Name: Выделение прародителей мегакариоцитов мыши (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Узнайте метод выделения прародителей мегакариоцитов мыши с использованием магнитной деплеции линии и сортировки клеток. Этот протокол повышает выход клеток за счёт подвздошного гребня и снижает число животных.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы поблагодарить Моник Фройнд, Катрин Циссель и Кетти за техническую помощь. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в области медицины и санте publique) и грантом ANR-17-CE14-0001-01 для Henri.de la. Саль.

<ol><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li>
<li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2%2Fflt3%2B+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li>
<li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+bipotent+%28erythroid+and+megakaryocytic%29+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li>
<li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+phenotypic%2C+functional%2C+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li>
<li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li>
<li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+thrombopoietin+%28TPO%29-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li>
<li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJOVE%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li>
<li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li>
<li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14(2014).</li>
<li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li>
</ol>

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Способ, описанный в данной работе, позволяет экстракцию и очистку мышиных MEP и MKp. Важным параметром в оптимизации протокола было получение достаточного количества клеток, которые были бы совместимы с большинством молекулярных и клеточных анализов. Общая практика сбора костной ткани мыши для извлечения кроветворных клеток обычно заключается в сборе как бедренных, так и большеберцовых костей каждой мыши. Таким образом, тазовая кость, еще один источник кроветворного материала, часто упускается из виду. Причинами, по кото...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Тромбоциты крови вырабатываются мегакариоцитами. Эти крупные полиплоидные клетки расположены в костном мозге и, как и все клетки крови, получены из гемопоэтических стволовых клеток (HSC)1. Классический путь производства мегакариоцитов в костном мозге берет свое начало от ГСК и предполагает генерацию различных прародителей, которые постепенно ограничивают их дифференцировальный потенциал2. Первым прародителем, подписавшим обязательство по мегакариоцитарной линии, является мегакариоцит-эритроцитарный прародитель (MEP), бипотентный прародитель, способный продуцировать как эритроидныеклетки,так и мегакариоциты3,4,5. Затем MEP производит унипотентный предшественник / предшественник (MKp), который будет дифференцироваться в зрелый мегакариоцит, способный продуцировать тромбоциты. Механизмы, участвующие в генерации этих прародителей, а также их дифференцировка и созревание в мегакариоциты сложны и понятны лишь частично. Кроме того, гетерогенность популяции MEP с точки зрения потенциала дифференцировки и внутреннего уровня приверженности этих клеток все еще неясна. Чтобы расшифровать эти процессы, важно получить (или иметь доступ) очищенные популяции MEP и MKp для тонкомолекулярного и одноклеточного анализа.
Несколько исследований продемонстрировали особые комбинации маркеров клеточной поверхности для идентификации прародителей, приверженных мегакариоцитарной линии у мышей6,7,8. Из них был разработан метод, позволяющий очищать MEP и MKp от мышей. Этот метод был оптимизирован для получения клеток в достаточном количестве и качестве для большого количества анализов. С учетом этических соображений и для того, чтобы свести к минимуму количество животных, участвующих в экспериментах, мы собрали костный мозг из бедренной и большеберцовой костей, а также из подвздошного гребня. Эта кость содержит высокую частоту и количество кроветворных прародителей и большую часть времени повреждается во время длительного сбора костной ткани. Здесь представлен подробный метод надежного сбора этой кости.
Вторым критерием оптимизации является создание высокоочищеных клеточных популяций. Флуоресцентная активированная сортировка клеток (FACS) является методом выбора для получения очищенных популяций интересующих клеток. Тем не менее, низкие урожаи достигаются, когда интересуемая популяция клеток очень редка. Таким образом, необходимы процедуры обогащения. В этом протоколе была выбрана процедура отрицательного отбора с использованием магнитных шариков.

<table><tbody><tr><td>Иглы 21 калибра</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Антитело Gr-1-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>Антитело</td></tr><tr><td>магнитного истощения B220-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>Антитело магнитного истощения</td></tr><tr><td>Mac-1-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>Магнитное истощение истощение</td></tr><tr><td>Антитело CD3e-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Антитело к магнитному истощению</td></tr><tr><td>CD4-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Антитело к магнитному истощению</td></tr><tr><td>CD5-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Антитело к магнитному истощению</td></tr><tr><td>CD8a-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Антитела к магнитному истощению</td></tr><tr><td> TER119-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>Антитело</td></tr><tr><td>магнитного истощения CD127-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>Антитело магнитного истощения</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Антитело для сортировки клеток</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>Антитело для сортировки клеток</td></tr><tr><td>TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>Сортировка клеток</td></tr><tr><td>Антитело CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>Сортировка клеток</td></tr><tr><td>Антитело CD45-биотин</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>Сортировка клеток</td></tr><tr><td>Антитело CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>Сортировка клеток</td></tr><tr><td>Антитело&nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Сортировка клеток</td></tr><tr><td>Антитело Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>Сортировка клеток</td></tr><tr><td>Антитело CD16/32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Сортировка клеток</td></tr><tr><td>Антитело CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Сортировка клеток Питательная</td></tr><tr><td>среда StemSpan-SFEM Stemcell</td><td>technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Диск для вскрытия</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Этанол</td><td>vWR Chemicals</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Щипцы</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>Стеклянный пипетка для пастера</td><td>Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>Магнит :&nbsp; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Магнитные бусины: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Megacult</td><td>Stemcell technologies</td><td>#04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Stemcell technologies</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Сыворотка для новорожденных теленков</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Лизис эритроцитов раствор</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Скальпели</td><td>Fisher Scientific</td><td>12308009</td><td></td></tr><tr><td>Ножницы</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>Стерильные шприцы</td><td>1 мл BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Стерильные 15 мл пробирки</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Стерильные 5 мл полипропиленовые тубы</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Стерильные полистирольные тубы 5 мл</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Стерильные пробирки с 70&микро; m Крышка фильтра для клеток</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Стерильная чашка</td><td>Петри Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>стрептавидин-APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>554063</td><td>Клеточная сортировка</td></tr><tr><td>Трубка роликовая</td><td>Benchmark Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

Выделение прародителей мегакариоцитов мыши

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Мегакариоциты костного мозга представляют собой крупные полиплоидные клетки, обеспечивающие выработку тромбоцитов крови. Они возникают из гемопоэтических стволовых клеток через мегакариопоэз. Заключительные этапы этого процесса сложны и классически включают бипотентные мегакариоцитарно-эритроцитарные прародители (MEP) и унипотентные мегакариоцитарные прародители (MKp). Эти популяции предшествуют образованию настоящих мегакариоцитов, и, как таковые, их выделение и характеристика могут позволить провести надежный и непредвзятый анализ образования мегакариоцитов. В этом протоколе подробно представлена процедура сбора кроветворных клеток из костного мозга мыши, обогащение гемопоэтических прародителей путем магнитного истощения и, наконец, стратегия сортировки клеток, которая дает высокоочищенные популяции MEP и MKp. Во-первых, клетки костного мозга собираются из бедренной кости, большеберцовой кости, а также подвздошного гребня, кости, которая содержит большое количество кроветворных прародителей. Использование костей подвздошного гребня резко увеличивает общее количество клеток, получаемых на мышь, и, таким образом, способствует более этичному использованию животных. Истощение магнитной линии было оптимизировано с использованием магнитных шариков 450 нм, что позволило очень эффективно сортировать ячейки с помощью проточной цитометрии. Наконец, в протоколе представлена стратегия маркировки и сортировки двух высокоочищеных популяций-прародителя мегакариоцитов: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim)и MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Этот метод прост в реализации и обеспечивает достаточно клеточного материала для выполнения i) молекулярной характеристики для более глубокого знания их идентичности и биологии, ii) анализов дифференцировки in vitro, которые обеспечат лучшее понимание механизмов созревания мегакариоцитов, или iii) in vitro моделей взаимодействия с их микросредой.

Фенотипический анализ клеток, идентифицированных как MEP и MKp, проводили методом проточной цитометрии. Клетки были помечены флуоресцентными конъюгированными антителами к CD41a и CD42c, классическим маркерам мегакариоцитарных и тромбоцитарных линий. Оба маркера были экспрессированы клетками популяции MKp, в то время как эти маркеры еще не обнаружены на поверхности клеток популяции MEP(Рисунок 4Ai,4Aii). Полиплоидия является отличительной чертой мегакариоцитов. Содержание ДНК...

Этот метод описывает очистку с помощью проточной цитометрии MEP и MKp от бедренных костей, большеберцовой кости и костей таза мышей.

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Выделение ключевых популяций-прародителя мегакариоцитов позволяет провести тонкий анализ иерархии линий в клеточной культуре на молекулярных анализах, вплоть до уровня одной клетки. Этот протокол сочетает в себе более этичную практику, сводя к минимуму количество необходимых животных в эффективном процессе сортировки клеток популяций MEP и MKP. Для кости спрей для сбора распылит тело восьми-12-недельной черной шестимышечного C57 с 70% этанолом.Используйте ножницы, чтобы сделать точечный пяти-сантиметровый разрез кожи, перпендикулярный позвоночнику. И разорвать кожу по всему телу, потянув ее вниз. Поместите мышь лицевой стороной вниз на подушечку для рассечения, затем найдите тазовые кости, скользя пальцами или ножницами, вдоль открытого позвоночника, сверху вниз.Чтобы найти подвздошный гребень, определите небольшую шишку в поясничной области возле задних конечностей. Положив ножницы параллельно позвоночнику, против позвонков и вплотную к бугоре подвздошного гребня, приступайте к разрезанию мышц вдоль стороны позвоночника над тазовой костью, скользя ножницами вдоль позвонков, вниз к хвосту. Затем разрезают между позвонками и подвздошной гребнем, оставаясь как можно ближе к позвонку.И отрежьте оставшиеся мышцы, чтобы отсоедать конечность от тела. Перенесите отслоившенные конечности на чистую поверхность. После отбрасывания остальной части тела в соответствии с институциональными рекомендациями используйте щипцы и скальпели, чтобы обнажить тазовые, бедренные и большеберцовые кости, удалив окружающие ткани.Используйте щипцы, чтобы удерживать дистальный конец бедренной кости, и осторожно вывихнуть головку бедренной кости от тазовой кости, осторожно нарезая мышцы вокруг сочленения скальпелем. Соскоблите оставшуюся мышцу с тазовой кости и вырежьте в середине полости, которая удерживала головку бедренной кости. Сохраните подвздошную кость и отбросьте треугольную тонкую сторону кости.Используя скальпель, удалите остаточные ткани вокруг подвздошной кости и поместите очищенную кость в стерильный PBS, дополненный сывороткой 2% newborn Calf Serum. Затем с помощью ножниц отрежьте ногу от ноги на лодыжке. Удерживая нижнюю часть большеберцовой кости щипцами, соскоблите мышцу вверх к колену.Отбросьте малоберцовую киболу. Затем сделайте разрез по большеберцовой кости плато скальпелем и поместите большеберцовую кость в стерильный PBS 2%NBCS. После удаления остаточных тканей вокруг бедренной кости удерживайте верхнюю сторону бедренной кости щипцами, а лезвие скальпеля поместите у основания коленной чашечки.Приложи усилие к коленной чашечке, параллельно бедренной кости, чтобы отсоедить коленную чашечку. Затем поместите бедренную комочку, в стерильный PBS 2%NBCS. В ламинарной проточной шкафу переложите кости в стерильную чашку Петри, наполненную стерильным PBS 2%NBCS.Используйте скальпель, чтобы отрезать головку бедренной кости. Наполните шприц на один миллилитр стерильным PBS 2% NBCS и прикрепите к розетке иглу 21 калибра. Затем заполните пятимиллилитровую полипропиленовую трубку двумя миллилитрами стерильного PBS 2%NBCS.Удерживая бедренную кость щипцами, вставьте иглу в канавку слева, после снятия коленной чашечки, применив вращение, убедившись, что игла полностью вставлена в кость, вплоть до скоса. После введения иглы переведите кость с иглой в трубку, содержащую два миллилитра PBS 2%NBCS. Затем дозируют и аспирируют PBS 2% NBCS, из шприца до тех пор, пока кость не очистится.Извлеките иглу из бедренной кости, и вставьте ее в отверстие на противоположной стороне, где находилась головка бедренной кости. После дозирования и аспирации буфера отбросьте кость. Для подвздошного гребня и большеберцовой кости используйте щипцы, чтобы удерживать кость и осторожно вставить иглу в открытую сторону, применяя вращение.Обеспечение того, чтобы игла была полностью вставлена в кость, вплоть до скоса. Затем переведите кость с иглой в трубку, содержащую два миллилитра PBS 2%NBCS. Дозировать и аспирировать PBS 2% NBCS из шприца до тех пор, пока кость не очистится.Пропустите всю клеточную суспензию через 40-микроновый колпачок клеточного сетчатого фильтра, помещенный на стерильную пятимиллилитровую полистирольную трубку, и добавьте 500 микролитров PBS 2% NBCS. Отложите в сторону 100 микролитров клеточной суспензии в качестве общего костного мозга. Затем храните его на льду для процедуры окрашивания.Гранулировать фильтрованную суспензию центрифугированием. После выброса супернатанта повторно суспендировать гранулу в свежеприготовленном коктейле первичных антител с инкубацией на льду в течение 30-45 минут. Отложите 10 микролитров клеточной суспензии в стерильную пятимиллилитровую полистирольную трубку с маркировкой Lin Pores Fraction и добавьте 90 микролитров PBS 2% NBCS.Тем временем подготовьте бусины для магнитного истощения, повторно развернув их во флаконе, с тщательным вихрем в течение 30 секунд. Переложите объем бусин, соответствующий двум шарикам на целевую ячейку, в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку и дважды промыть бусины с PBS 2% NBCS, поместив трубку на магнит. После снятия промывного буфера стерильной стеклянной пастерной пипеткой повторно суспендировали бусины в 500 микролитрах стерильного PBS 2%NBCS.Для первого этапа магнитного истощения добавьте 250 микролитров бусин на гранулу промытых клеток и высиживайте с мягким перемешиванием в течение пяти минут на льду. Затем добавьте два миллилитра стерильного PBS 2%NBCS, с мягким перемешиванием, и поместите трубку в магнит на две минуты. Приступайте к сбору ноголентической фракции стерильной стеклянной пастерной пипеткой.А для второго шага магнитного истощения добавьте его к оставшимся 250 микролитрам магнитных шариков. Поместите тюбик, запечатанный парафином, на трубчатый валик, на 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем добавьте два миллилитра стерильного PBS 2%NBCS с мягким перемешиванием.И поместите трубку с магнитом на две минуты. Соберите немагнитную фракцию в стерильную пятимиллилитровую полипропиленовую трубку, меченую, немагнитную фракцию Лин Нег, со стерильной стеклянной пипеткой пастрера и приступайте к сортировке клеток-прародителей мегакариоцитов, как описано в текстовой рукописи. Для стратегии сортировки клеток в популяции Лин Нег выбираются клетки, экспрессирующие С-кит, и низкая или нулевая экспрессия антигена Sca-1 или CD16/32.В этой популяции MEP идентифицируются как CD150 положительные и CD9 тусклые клетки. MKP как CD150 положительные, так и CD9 яркие клетки. В репрезентативном анализе проточной цитометрии клетки, идентифицированные как MEP и Mkp, были помечены флуоресцентными конъюгированными антителами к CD41a и классическим маркерам CD42c мегакариоцитарных и тромбоцитарных линий.Оба маркера были экспрессированы клетками популяции MKp и не были обнаружены на поверхности клеток популяции MEP. Содержание ДНК отсортированных мегакариоцитов продемонстрировало, что клетки в основном 2n для популяции MEP. И небольшая часть клеток MKp является чужеродной.Клетки с более высокой плоидией не были значительно обнаружены в этих популяциях. В полутвердых клоногенных анализах КОЕ-МК был обнаружен как в популяциях MEP, так и mKp. BFU-E не был обнаружен в популяции MKp, но обнаружен в MEP и CD150 отрицательной CD9 популяции клеток-прародителя.Микроскопические наблюдения на третий день дифференцировки показывают, что MEP и MKp продуцируют в основном мегакариоциты, идентифицированные как крупные клетки. Мегакариоциты, полученные после трех дней культивированности, были идентифицированы с использованием экспрессии CD41 и CD42c и представляют собой 54 и 82% клеток, продуцированных из клеточных популяций MEP и MKp соответственно. Плоидия вырабатываемых мегакариоцитов была больше из мегакариоцитов, полученных из популяции MKp, по сравнению с популяцией MEP.Только клетки, полученные из популяции MKp, были способны к проплатлетной эмиссии, что предполагает более продвинутую стадию созревания для популяции MKp. Использование тазовой кости резко увеличивает количество клеток, в то время как двухступенчатое магнитное истощение повышает эффективность истощения линии. Этот протокол позволяет проводить последующую культивирование ПОПУЛЯЦИИ MEP и MKp одиночных клеток, которые вместе с транскриптомическим и протеомным анализом непременно должны будут расшифровать задействованные механизмы, реализованные биогенезом.

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Метод ферментативной диссоциации, маркировка поверхности и очистки с помощью проточной цитометрии фиброзно / адипогенной и миогенной прародителей из мышиных скелетных мышцах.

Очистка прародителей из скелетных мышц

Метод анализа распределения костного мозга гемопоэтических предшественников в проточной цитометрии, а также эффективно изолировать высокой степени очистки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) описывается. Изоляция процедуры по существу на основе магнитного обогащения с-Kit + клеток и сортировку, чтобы очистить ГСК на клеточных и молекулярных исследований.

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

Здесь мы представляем протокол, который генерирует большое количество моноцитов мышей из гетерогенного костного мозга для трансляционных приложений. По сравнению с другими, этот новый метод помогает сократить количество приносимых в жертву животных и снижает затраты, избегая дорогостоящих методов, таких как высокоградиентное разделение магнитных клеток (MACS).

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

Гемопоэтические стволовые и клетки-предшественники (HSPC) вытекают из специализированных (кроветворный) эндотелиальных клеток в процессе развития, но мало известно о процессе, с помощью которого некоторые эндотелиальные клетки указать, чтобы стать кроветворные. Мы демонстрируем метод, основанный проточной цитометрии, позволяющий одновременное выделение кроветворных эндотелиальных клеток и HSPC из мышиных эмбриональных тканей.

Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

Здесь мы описываем оптимизированный, высоковоспроизводимый протокол для выделения мезодермальных клеток-предшественников (МПК) из костного мозга человека (hBM). МПК характеризовались проточной цитометрией и экспрессией нестинов. Они показали способность давать начало экспоненциально растущим МСК-подобным клеточным культурам, сохраняя при этом их ангиогенный потенциал.

Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека

Мы описываем иммуномагнитная изоляции первичных мыши олигодендроциты, который позволяет быстрый и конкретный изоляции клеток в vitro культуры.

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

Мы показали, как идентифицировать и изолировать 6 подмножеств миелоидного прародителей из мышиных костного мозга с помощью комбинации магнитных и флуоресценции, сортировка (MACS и СУИМ). Этот протокол может использоваться для в vitro assays культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи экспериментов и РНК/белка анализа.

Выявление и изоляция Oligopotent и Lineage, совершенные миелоидного предшественники костного мозга мыши

Здесь мы подробно описываем метод эксплантации костного мозга, от пробоподготовки до микроскопического анализа слайдов, для оценки способности мегакариоцитов, которые дифференцировались в своей физиологической среде, образовывать проплацелеты.

Динамика образования проплатлетов эксплантов костного мозга мыши

В настоящее время признано, что трехмерная среда клеток может играть важную роль в их поведении, созревании и / или дифференцировки. Этот протокол описывает трехмерную модель клеточной культуры, предназначенную для изучения влияния физической локализации и механических ограничений на мегакариоциты.

Культура мегакариоцитов в 3D-гидрогеле на основе метилцеллюлозы для улучшения созревания клеток и изучения влияния жесткости и удержания

Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.

Выделение первичной микроглии мыши методом магнитно-активированной сортировки клеток на животных моделях демиелинизации

В этом исследовании был разработан стабильный и эффективный метод выделения, культивирования и функционального определения CD34+ стволовых клеток сосудистой стенки (CD34+ VW-SCs). Этот простой в использовании и эффективный по времени метод изоляции может быть использован другими исследователями для изучения потенциальных механизмов, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Иммуномагнитная изоляция CD34+ стволовых клеток сосудистой стенки от мышей

Узнайте метод выделения прародителей мегакариоцитов мыши с использованием магнитной деплеции линии и сортировки клеток. Этот протокол повышает выход клеток за счёт подвздошного гребня и снижает число животных.

Выделение прародителей мегакариоцитов мыши

Больше видео