Лабораторные испытания генетически модифицированных анофелиновых комаров в малой клетке
1 мая 2021 г.
Протоколы, представленные здесь, иллюстрируют три альтернативных способа оценки эффективности генетически модифицированных комаров, предназначенных для борьбы с переносчиками в лабораторных испытаниях в небольших клетках. Каждый протокол адаптирован к конкретной модификации штамма комара (генный драйв или негенный драйв) и типам измеряемых параметров.
Протокол, описанный здесь, подходит для оценки эффективности трансгенных комаров и сравнения с аналогами дикого типа в небольших лабораторных испытаниях в клетке. Испытания в небольших клетках имеют важное значение для получения эмпирических ценностей, которые помогут внедрить новые технологии элиминации малярии. Испытания в клетке могут быть адаптированы к другим экспериментальным проектам и подходят для оценки динамики угрозы трансгена желания.
После интродукции трансгенные особи. Начните начальную фазу эксперимента с установки трех клеток по 0,216 кубических метра в трех экземплярах. И добавление 60 личинок дикого типа в каждую клетку в течение трех последовательных недель.
Каждую неделю обеспечьте взрослых самок в каждой клетке обезболенных мышей в качестве источника кровяной муки. И контейнер для яйцекладки через три дня после приема пищи с кровью. Высиживают яйца из каждой клетки еженедельно.
С четвертой по восьмую неделю выберите 60 личинок L2 второго звезды случайным образом, чтобы вернуться в свои соответствующие клетки. На девятой неделе случайным образом назначьте один набор тройных клеток в качестве контрольных элементов и один набор для каждого желаемого коэффициента высвобождения. Добавляйте 60 куколок дикого типа с 30 самцами и 30 самками в контрольные клетки еженедельно.
Поддерживайте соотношение один к одному в каждой соответствующей клетке, еженедельно добавляя 30 трансгенных самцов куколок вместе с 60 куколками дикого типа. Для соотношения один к 0,1 добавьте 300 трансгенных мужских куколок еженедельно в каждую соответствующую клетку вместе с 60 куколками дикого типа. Повторяйте добавление куколок комаров в клетку, обеспечивая кровавую муку и инкубационные яйца каждую неделю.
Выберите в общей сложности 300 личинок из каждой клетки случайным образом для скрининга. Экранирование личинок под стереомикроскопом с флуоресцентными фильтрами для экспрессии флуоресцентного доминантного маркера на личиночной и куколочной стадиях. Оцените пол полученных куколок.
В эксперименте по генному драйву используйте барьерную стратегию, удерживая комаров в безопасном инсектарии и следуя стандартным операционным процедурам с регулярным мониторингом. Подготовьте клетку, установленную с двумя наборами тройных клеток по 0,216 кубических метра для каждого желаемого трансгенного и дикого типа мужского высвобождения. Чтобы достичь соотношения высвобождения самцов один к одному, добавьте 120 трансгенных самцов, 120 самцов дикого типа и самок на стадии куколки к каждой реплицированной клетке.
Обеспечьте кровавую пищу с помощью анестезированных мышей четырех-семидневным самкам в каждой клетке. После инкубации яиц в личиночном лотке выберите примерно 240 первых личинок L1 случайным образом из каждой клетки и вырастите их до куколок, прежде чем вернуться в соответствующие клетки. Выберите и отсейте личинок на наличие глазного маркера и фенотипа пола, как описано выше.
Соберите клеточную установку из тройных клеток объемом 0,005 кубических метра с равным количеством самцов и самок для каждого конкретного соотношения высвобождения трансгенных и диких самцов. Используя аппарат искусственного питания, обеспечьте кровяную пищу четырех-семидневным самкам в каждой клетке в течение двух последовательных дней. Через три дня после второго приема пищи добавьте контейнер для яйцекладки и удалите контейнеры через три дня.
После подсчета всех мертвых и живых взрослых особей, оставшихся в клетке по полу, храните их при минус 80 градусах Цельсия для молекулярного анализа. Высиживают яйца и запускают отбор 200 личинок L1 и откладывают личинок в сторону, чтобы заселить новые клетки для следующего поколения. Затем случайным образом выберите еще 500 личинок из каждой клетки, отведенной для скрининга.
Вырастите отобранные 200 личинок до куколки и 500 личинок до стадии L4 instar. Верните куколку из 200 лотков для заселения новой клетки. Скрининг случайно выбранных личинок на маркер глаза и фенотип пола Как и раньше.
В репрезентативном анализе показана ожидаемая динамика фенотипов наиболее эффективных реплик для различных протоколов испытаний популяционной замещающей клетки. Результаты показали линейное увеличение доли личинок с фенотипом маркера DsRed в течение семи поколений. Выпуск один к одному без привода достиг чуть более 80% внедрения трансгена в течение семи поколений.
Протоколы генного драйва достигли этого в течение трех-четырех поколений. Таким образом, подтверждение того, что однократное высвобождение системы генного драйва может быть более эффективным для внедрения трансгенов. В конце наблюдения распространение трансгена достигло почти полного внедрения в системы генного драйва.
Важные параметры, такие как коэффициент высвобождения популяции, возрастная структура, размер клетки и другие, будут варьироваться в зависимости от цели эксперимента и конкретных целей. Эксперименты для оценки параметров приспособленности, таких как фертильность и плодовитость, могут быть проведены. Дальнейшие эмпирические данные испытаний в клетке могут быть использованы для параметризации математических моделей динамики популяции.
Обзор
В данной статье представлены протоколы оценки генетически модифицированных комаров в ходе испытаний в небольших клетках, направленных на контроль переносчиков заболеваний. Предложенные методы адаптированы под различные генетические модификации и позволяют оценить разнообразные параметры эффективности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная инженерия
- Контроль переносчиков
- Энтомология
Теоретические сведения
- Для искоренения малярии разрабатываются трансгенные комары.
- Испытания в небольших клетках позволяют получить эмпирические данные для оценки этих технологий.
- Протоколы различаются в зависимости от генетических модификаций комаров.
- Понимание показателей эффективности имеет решающее значение для внедрения данной технологии.
Цель исследования
- Оценить эффективность генетически модифицированных комаров.
- Сравнить трансгенных комаров с особями дикого типа.
- Предоставить данные для внедрения новых технологий контроля переносчиков.
Используемые методы
- Подготовка небольших лабораторных клеток для проведения испытаний.
- Помещение личинок дикого типа и трансгенных личинок в контролируемом соотношении.
- Мониторинг стадий личинки и куколки для выявления генетических маркеров.
- Применение стратегии барьера для экспериментов по генному драйву.
Основные результаты
- Системы генного драйва обеспечили более высокие показатели внедрения трансгена.
- Показатели эффективности варьировались в зависимости от соотношения выпускаемых особей и размеров клеток.
- Эмпирические данные подтверждают результаты математического моделирования динамики популяций.
- Трансгенные комары продемонстрировали многообещающие результаты в замещении популяции.
Выводы
- Системы генного драйва позволяют эффективно вводить трансгены.
- Испытания в клетках малого размера эффективны для оценки показателей жизнедеятельности комаров.
- Необходимы дальнейшие исследования для оценки параметров приспособленности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оценка эффективности трансгенных комаров в ходе испытаний в небольших лабораторных клетках позволяет получить эмпирические данные, необходимые для снижения рисков применения технологий генного драйва перед их внедрением в полевых условиях. Данные протоколы обеспечивают систематическое сравнение динамики распространения трансгена между популяциями дикого типа и модифицированными популяциями, что способствует прогностическому моделированию стратегий борьбы с переносчиками малярии. Такой подход помогает приоритизировать конструкции генного драйва с более высокой эффективностью внедрения для последующих доклинических и полевых испытаний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать закономерности наследования трансгена и эффекты приспособленности в контролируемых испытаниях по замещению популяций.
- Практическая ценность: стандартизирует оценку эффективности генного драйва посредством количественного определения экспрессии маркеров в разных поколениях.
- Прогностическая ценность: помогает принимать решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований путем оценки временных рамок по поколениям для достижения порогового уровня внедрения трансгена.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Устанавливает протоколы флуоресцентного скрининга доминантных маркеров на личиночной и куколочной стадиях для отслеживания частоты трансгена.
- Практическая ценность: Определяет воспроизводимые рабочие процессы отбора личинок и фенотипирования пола для стабильного мониторинга смен поколений.
- Готовность метода: Предоставляет адаптируемые конфигурации клеток для различных пропорций выпуска с целью моделирования различных сценариев вмешательства.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает лабораторные результаты с экспериментами в полевых клетках путем генерации параметризуемых данных для моделей популяционной динамики.
- Механистическое снижение рисков: изолирует такие переменные, как соотношение при выпуске и размер клетки, для оценки их влияния на распространение трансгена независимо от сложности окружающей среды.
- Прогностическая достоверность: подтверждает, что разовые выпуски с использованием генного драйва обеспечивают более быстрое внедрение трансгена, чем подходы без использования драйва, что позволяет уточнить ожидания относительно зависимости «доза-эффект».
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум от поиска до доклинических исследований, позволяя получать предварительные данные об эффективности инструментов генетического контроля векторов, что служит основой для этапов идентификации перспективных кандидатов и доклинической валидации.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверять функциональные гипотезы о механизмах генного драйва путем прямого наблюдения за изменением частоты трансгена в ряду поколений.
- Скрининг: Обеспечивает получение количественных данных о доле личинок с положительным маркером, что позволяет сравнивать различные генетические конструкции и условия выпуска.
- Аналитика: Позволяет получать данные о траектории развития популяций по поколениям, пригодные для построения математических моделей замещения популяций и пороговой динамики.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность перехода от испытаний в малых клетках к испытаниям в полевых клетках, предоставляя эмпирические параметры приспособленности и распространения.
- Применение в различных проектах: Представляет собой модульную платформу, применимую к различным системам генного драйва и видам переносчиков, помимо комаров рода Anopheles.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в эффективности генного драйва, предоставляя эмпирические показатели скорости распространения в стандартизированных условиях.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет четко определенных графиков введения личинок, кормления кровью, откладки яиц и скрининга.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления перспективных кандидатов для генного драйва, что снижает потери на поздних этапах разработки.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию технологий контроля переносчиков с учетом рисков на основе эталонных показателей внедрения трансгена в поколениях.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разведении комаров, скрининге генетических маркеров и методах переписи популяции.
- Зависит от доступа к флуоресцентной микроскопии, контролируемым условиям в инсектарии и источникам крови для кормления.
- Необходимы стандартные операционные процедуры по созданию барьерной изоляции в экспериментах с генным драйвом для предотвращения утечки.
- Требуется учет особенностей адаптации при изменении размеров клеток или модификации пропорций выпуска для различных целей эксперимента.
- Ограничено рамками лабораторного масштаба при моделировании экологических факторов, присутствующих в полевых условиях.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Inundative Release Trials on Non-Gene Drive Mosquitoes
2:59
Overlapping Generation Trials of Gene-Drive Mosquitoes
4:17
Non-overlapping Generation Trials of Gene-Drive Mosquitoes
5:59
Results: Predicted Transgene Fixation Dynamics Over Seven Generations
7:02
Conclusion
