Ультрацентрифугирование градиента плотности для исследования эндоцитарной рециркуляции в клетках млекопитающих
30 июня 2021 г.
Целью данной статьи является представление протокола подготовки рециркулирующих эндосом из клеток млекопитающих с использованием ультрацентрифугирования ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы.
Этот протокол помогает изолировать рециркулирующие эндосомы, содержащие фракцию, из трансфектированных клеток млекопитающих, чтобы облегчить расследование незаконного оборота белка через эндоцитарный трафик. Этот метод прост в обращении и применим как к образцам тканей, так и к образцам клеток. Продемонстрировать процедуру будет мисс Чжай Ю Ци, аспирант из лаборатории доктора Лао.
Для начала нанесите 2 раза по 10 на 6 клеток в 100-миллиметровую культуральную чашку. На следующий день трансфектируют клетки липофектамином согласно инструкции производителя. Чтобы собрать клетки, выбросьте культуральную среду через 48 часов после трансфекции и дважды промыть клетки ледяным PBS.
Затем добавьте один миллилитр ледяного PBS, дополненного коктейлем ингибитора протеазы 0,5X в коктейле ингибитора фосфатазы 0,5X. Затем, используя клеточный скребок, соберите ячейки и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую центрифужную трубку. ячейки центрифугированием с использованием поворотного ротора ковша.
Отбросьте супернатант и осторожно повторно суспендируйте гранулу ячейки в пяти миллилитрах буфера гомогенизации. Соберите клетки снова путем центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу клетки в одном миллилитре буфера гомогенизации. Гомогенизируйте клетки гомогенизатором Dounce, используя от 15 до 20 ударов.
Затем переложите гомогонат на двухмиллилитровую центрифугированную трубку. Добавьте к гомогонату 700 микролитров буфера гомогенизации. Затем раскрутите разбавленный омогонат и соберите 1,5 миллилитра супернатанта.
Снова вращайте собранный супернатант, затем соберите 1,4 миллилитра супернатанта и пометьте его как постядерный супернатант. Чтобы подготовить колонку градиента плотности, переложите 1,2 миллилитра постядерного супернатанта в ультрацентрифужную трубку. Затем к образцу добавляют один миллилитр 62%-ного раствора сахарозы и хорошо перемешивают путем бережного пипетирования.
Затем осторожно добавляют 3,3 миллилитра 35%-ного раствора сахарозы поверх образца, а затем 2,2 миллилитра 25%-ного раствора сахарозы поверх 35%-ного раствора сахарозы. Наконец, заполните трубку ультрацентрифуги сверху буфером гомогенизации. Центрифугируйте столбец градиента плотности и аккуратно соберите 12 фракций по 1 миллилитру каждая, начиная с вершины градиента.
Далее разбавляют все фракции одним миллилитром буфера разбавления и центрифугируют разбавленные образцы. После центрифугирования аспирируйте супернатант и добавьте 50 микролитров буфера образца 1X для сбора фракций. Рециркулирующий эндосомный маркер Rab11 был обнаружен в седьмой фракции.
Другие субклеточные маркеры, включая бета COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 и Lamp1, также были исследованы. Положительный сигнал EEA1 был также обнаружен в седьмой фракции. Измеренные полосовые интенсивности GAPDH, Cox IV и Rab11 как в седьмой фракции, так и в постядерном супернатанте показаны здесь.
После транссекции клеток HEC293 с ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L или ELMO1 ARF6Q67L FE65 не было обнаружено никаких изменений в распределении ELMO1 с гиперэкспрессией ARF6Q67L и FE65. Уровень ELMO1 в седьмой фракции сравнивали между различными трансфекциями и обнаружили повышенный после котрансфекции ARF6Q67L. Дальнейшее увеличение наблюдалось при совместной экспрессии ARF6Q67L и FE65.
И наоборот, выбивание FE65 уменьшило обогащение Elmo1, опосредованное ARF6, в седьмой фракции. Полученная фракция может быть использована для последующего анализа. Например, вестерн-блоттинг для визуализации изменений уровня белка во фракции.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен протокол выделения рециклирующих эндосом из клеток млекопитающих с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Этот метод разработан для облегчения изучения транспорта белков по эндоцитозным путям.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Эндоцитоз
- Транспорт белков
Теоретические основы
- Рециклирующие эндосомы играют ключевую роль в клеточном транспорте.
- Понимание механизмов транспорта белков необходимо для изучения различных клеточных процессов.
- Ультрацентрифугирование является широко используемым методом выделения клеточных компонентов.
- Данный протокол применим как к образцам тканей, так и к образцам клеток.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод выделения рециклирующих эндосом.
- Углубить понимание механизмов эндоцитозного транспорта.
- Создать основу для будущих исследований динамики белков внутри клеток.
Используемые методы
- Трансфекция клеток млекопитающих с помощью Lipofectamine.
- Сбор клеток через 48 часов после трансфекции.
- Промывка клеток ледяным PBS.
- Использование ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы для изоляции.
Основные результаты
- Успешное выделение рециклирующих эндосом из трансфицированных клеток.
- Демонстрация протокола аспирантом.
- Обеспечение условий для дальнейших исследований транспорта белков.
- Подтверждение применимости метода к различным типам образцов.
Выводы
- Данный протокол представляет собой простой способ выделения рециклирующих эндосом.
- Ожидается, что он поможет в понимании механизмов транспорта белков.
- Этот метод может быть использован в различных контекстах биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Изоляция рециклирующих эндосом позволяет снизить механистические риски при выборе мишеней эндоцитозного транспорта, предоставляя количественные данные о субклеточном фракционировании. Это способствует валидации мишеней и разработке методов анализа белков, регулирующих рециклинг мембранных белков, таких как эффекторы ARF6. Данный метод повышает прогностическую достоверность идентификации перспективных соединений-лидеров, связывая локализацию белка с функциональными путями рециклинга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы о регуляторах эндоцитозного рециклинга, таких как ARF6 и ELMO1.
- Практическая ценность: Предоставляет данные фракционирования для уточнения механизмов транспорта белков по специфическим путям.
- Научная ценность: Способствует снижению биологических рисков путем подтверждения взаимодействия с мишенью во фракциях рециклирующих эндосом.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных фракций, содержащих рециклирующие эндосомы, для последующего анализа методом Вестерн-блоттинга.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизированного, воспроизводимого выделения органелл для количественного определения белков.
- Научная ценность: Подготовка анализа для скрининга соединений, модулирующих рециклирование эндосом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает данные о транспорте веществ на этапе открытия с доклиническими моделями путем изоляции Rab11-положительной фракции.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от субклеточного фракционирования до функциональной валидации в системах, релевантных для заболевания.
- Научная ценность: Поддерживает продвижение проекта с учетом рисков путем подтверждения локализации мишени в путях рециркуляции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарственных средств путем выделения субклеточных фракций, что позволяет принимать обоснованные решения по валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез о регуляторах эндоцитозного рециклинга с помощью фракционирования и анализа маркеров.
- Скрининг: Обеспечивает разработку анализов посредством стандартизированного выделения Rab11-положительных фракций для количественного определения белков.
- Аналитика: Позволяет получать количественные данные вестерн-блоттинга из фракций для сравнения обогащения белков при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает данные фракционирования с доклинической преемственностью путем валидации выделения рециклирующих эндосом.
- Корпоративное повторное использование: Предоставляет многократно используемую платформу для субклеточного фракционирования в рамках нескольких проектов по валидации мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности путей трафика.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость изоляции органелл для согласованного последующего анализа.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), предоставляя данные о субклеточной локализации мишеней пути рециклизации.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе данных об обогащении рециклирующих эндосом.
Рекомендации по внедрению
- Требуются навыки работы с культурами клеток, методы трансфекции и ультрацентрифугирования.
- Метод зависит от наличия ультрацентрифуг и роторов с качающимися стаканами для разделения в градиенте плотности.
- Необходима стандартизация протоколов фракционирования между исследовательскими группами для получения сопоставимых фракций Rab11.
- Требуется адаптация панелей маркеров (например, Rab11, EEA1) для различных типов клеток или путей внутриклеточного транспорта.
- Ограничено необходимостью использования валидационных маркеров для подтверждения чистоты фракций перед последующим применением.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
