Пространственное профилирование экспрессии белка и РНК в тканях: подход к тонкой настройке виртуальной микродиссекции
6 июля 2022 г.
Здесь мы описываем протокол для тонкой настройки областей интереса (ROI) для технологий пространственной омики, чтобы лучше охарактеризовать микроокружение опухоли и идентифицировать конкретные клеточные популяции. Для анализов протеомики автоматизированные настраиваемые протоколы могут направлять выбор ROI, в то время как анализы транскриптомики могут быть точно настроены с использованием ROI размером до 50 мкм.
Этот протокол помогает направлять выбор областей, представляющих интерес для технологий пространственной омики, что позволяет более целенаправленно характеризовать ткани или клеточные популяции. Автоматизированный протокол для выбора ROI в анализах протеомики является более надежным и воспроизводимым, чем ручные протоколы, а использование 50-микрометровых ROI для анализов транскриптомики позволяет профилировать конкретные клеточные популяции. Начните с программирования автостейнера для применения флуоресцентных антител визуализации.
В программном обеспечении autostainer нажмите кнопку «Домой» и выберите «Протоколы». Затем нажмите «Создать/Изменить протоколы» и выберите RUO Discovery Universal в качестве процедуры. Нажмите «Первая последовательность», затем выберите «Депарафиназация», а затем «Депар v2».
Для средней температуры выберите 72 градуса цельсия, затем нажмите «Предварительная обработка» и выберите «Кондиционирование клеток» и резервуар CC1. Для параметра «Очень высокая температура» выберите «100 градусов по Цельсию», затем нажмите «CC1 восемь минут» и продолжайте нажимать, пока не будет выбран CC1 64 минуты. Нажмите «Ингибитор», затем выберите «Ингибитор DISCOVERY» и в поле «Время инкубации» выберите восемь минут.
Затем нажмите «Антитело», а затем «Инкубация высокотемповых антител». Для параметра «Низкая температура» выберите 37 градусов по Цельсию. Для антител выберите АНТИТЕЛО 6 с этикетки дозатора.
В поле Время инкубации Plus выберите 32 минуты. Нажмите на Multimer HRP, затем выберите Multimer HRP Blocker. Затем для блокировки антител выберите «Блокировать Ig».
А для параметра Время инкубации выберите четыре минуты. Затем на Multimer HRP Reagent выберите OMap Anti-Rb HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на Cy5 и для длительного времени инкубации выберите ноль часов, восемь минут.
Нажмите «Двойная последовательность» и выберите «Денатурация антител». Затем выберите Антитело Denature CC2-1, а для очень высокой температуры выберите 100 градусов Цельсия. Убедитесь, что время инкубации составляет восемь минут.
Затем нажмите на DS Inhibitor и выберите Нейтрализовать. Нажмите на DS Antibody, и для очень низкой температуры выберите 37 градусов по Цельсию. Затем в разделе Антитело выберите АНТИТЕЛО 3 с этикетки дозатора.
А для параметра Плюс Время инкубации выберите 32 минуты. Нажмите на DS Multimer HRP и выберите DS Multimer HRP Blocker. Затем для параметра «Блокировка антител» выберите «Блок Ig», а в поле «Время инкубации» выберите «Четыре минуты».
Затем на Multimer HRP Reagent выберите OMap anti-Ms HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на DS Rhodamine 6G, и для длительного времени инкубации выберите ноль часов, восемь минут. Нажмите на Triple Stain и выберите TS Antibody Denaturation, затем выберите Antibody Denature CC2-2, а для Very High Temperature выберите 100 градусов по Цельсию.
Убедитесь, что время инкубации составляет восемь минут. Затем нажмите на ингибитор TS и выберите TS Neutralize. Нажмите на TS Antibody, и для Very Low Temperature выберите 37 градусов по Цельсию.
Затем в поле Антитело выберите АНТИТЕЛО 7 на этикетке дозатора, а для Plus Incubation Time выберите 32 минуты. Нажмите на TS Multimer HRP и выберите TS Multimer HRP Blocker. Затем для параметра «Блокировка антител» выберите «Блок Ig», а в поле «Время инкубации» выберите «Четыре минуты».
Далее на Multimer HRP Реагент выберите OMap Anti-Rb HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на TS FAM, и для длительного времени инкубации выберите ноль часов, восемь минут. Нажмите «Сохранить» и добавьте заголовок к протоколу.
Выберите номер протокола, добавьте комментарий и нажмите «Активный», а затем «Сохранить». Выпекайте приобретенные продавцом парафиновые секции тканей человека в духовке, установленной на 70 градусов Цельсия, в течение 20-60 минут. Во время выпечки слайдов печатайте этикетки, нажав кнопку «Создать этикетку» в программном обеспечении autostainer.
Затем нажмите «Протоколы», выберите номер протокола и нажмите «Закрыть/Распечатать». Добавьте соответствующую информацию на этикетку слайда и нажмите «Печать». Выньте горки из духовки и дайте им остыть до комнатной температуры.
Примените ранее напечатанные наклейки протокола к соответствующим слайдам. Загружайте многоразовые диспенсеры антител антителами в соответствии с номерами этикеток антител. Разводят каждое антитело в указанном разбавителе и праймируют многоразовые дозаторы антител.
Соберите блокирующие, детектирующие и усиливающие предварительно заполненные дозаторы реагентов и поместите их на лоток реагентов прибора. Загрузите слайды в ящики для слайдов и нажмите «Выполняется», а затем «Да». Подтвердите начало запуска, проверив продолжительность выполнения на программном обеспечении autostainer.
На следующий день обеспечьте завершение пробега, наблюдая за зелеными мигающими огнями на слотах ящика слайдов. Затем снимите слайды с инструмента и энергично промойте слайды в 1-кратном реакционном буфере до тех пор, пока жидкий раствор не будет полностью удален. Замените SYTO 13 на SYTO 64 на 5 000 наномоляров, чтобы обеспечить интеграцию флуорофоров.
Разбавьте SYTO 64 в 1x TBS и инкубируйте в камере влажности в течение 15 минут. Используйте FITC для DISCOVERY Fam и установите экспозицию на 200 миллисекунд. Используйте Cy3 для DISCOVERY Родамин 6G и установите экспозицию на 200 миллисекунд.
Используйте Texas Red для SYTO 64 и установите экспозицию на 50 миллисекунд. Укажите SYTO 64 в качестве канала фокусировки и, наконец, используйте Cy5 для DISCOVERY Cy5. Установите экспозицию на 200 миллисекунд и сохраните изменения.
Выпекайте закрепленные формалином секции гранул с парафином в духовке, установленной на 70 градусов Цельсия, в течение 20-60 минут. Сканируйте слайды на платформе пространственного профилирования и выбирайте размеры 50 микрометров и 300 микрометров. Автоматизированный протокол визуализации был разработан путем включения одного элемента управления, чтобы подтвердить, что из соседних каналов не было кровотечения.
Тепловая карта log 2 всех маркеров, включенных в пространственный протеомический анализ, сравнивающий ручной протокол панцитокератина CD 45 черного цвета с автоматизированным 3-плексным протоколом серым цветом, показывает значение Spearman R 0,88. Из 31 антитела, использованного в анализах, 23 антитела имели значение R Spearman выше или равное 0,5. Тепловая карта log 2 выбранных мишеней, включенная в пространственный транскриптомический анализ, сравнивающая ручной протокол пан-цитокератина CD 45 в черном цвете с 3-плексным автоматизированным протоколом в сером цвете, показала различия в этих значениях.
Данные секвенирования для 3-плексного автоматизированного протокола визуализации представили более низкие значения по сравнению с пан-цитокератиновым протоколом ручной визуализации CD 45, что также отражено низкими значениями Spearman R 0,15. Также наблюдалась потеря динамического диапазона при использовании автоматизированного протокола 3-плексной визуализации. Обнаружение малых ROI в протоколе пространственной транскриптомики осуществлялось путем выбора круговых областей, представляющих интерес, при количестве РНК диаметром 50 микрометров и 300 микрометров для выбранных мишеней на разных клеточных линиях, которые были сопоставимы между двумя областями интересующих размеров после нормализации.
Этот протокол для автоматизированных панелей визуализации может быть адаптирован исследователями путем обмена маркерами для разработки панелей, которые точно определяют ROI для ответа на их вопросы пространственной протеомики.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе приводится руководство по выбору областей интереса (ROI) для технологий пространственной омики, что позволяет улучшить характеристику тканей и специфических популяций клеток. Автоматизированные протоколы выбора ROI в протеомных анализах повышают надежность и воспроизводимость результатов по сравнению с ручными методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Пространственная омика
- Протеомика
- Транскриптомика
Теоретические основы
- Технологии пространственной омики позволяют проводить детальную характеристику тканей.
- Автоматизированные протоколы оптимизируют процесс выбора областей интереса (ROI).
- Использование более мелких ROI позволяет улучшить профилирование конкретных популяций клеток.
- В процессе используются антитела для флуоресцентной визуализации.
Цель исследования
- Для уточнения выбора ROI (областей интереса) с целью более качественного анализа микроокружения опухоли.
- Для идентификации специфических популяций клеток в тканях.
- Для повышения точности и воспроизводимости анализов пространственной омики.
Используемые методы
- Программирование автоокрашивателя для флуоресцентной визуализации.
- Создание и редактирование протоколов в программном обеспечении автоокрашивателя.
- Применение автоматизированных протоколов для выбора ROI в протеомике.
- Использование ROI размером 50 µm для анализа транскриптомики.
Основные результаты
- Автоматизированные протоколы обеспечивают более согласованный выбор ROI.
- Меньшие области ROI позволяют проводить таргетное профилирование популяций клеток.
- Достигнута улучшенная характеристика микроокружения опухоли.
- Отмечена повышенная воспроизводимость в протеомных анализах.
Выводы
- Автоматический выбор ROI превосходит ручные методы.
- Тонкая настройка ROI может значительно улучшить анализ пространственной омики.
- Будущие применения могут еще больше уточнить характеристику тканей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Протоколы автоматизированной визуализации для выбора областей интереса (ROI) повышают воспроизводимость в пространственной протеомике, обеспечивая надежную валидацию мишеней и снижение рисков при изучении механизмов на ранних этапах поиска. Данный метод позволяет проводить количественный профиль белков с пространственным разрешением для проверки гипотез и уточнения сигнальных путей. Несмотря на несовместимость с пространственной транскриптомикой, данный подход демонстрирует возможность обнаружения специфических популяций клеток в малых ROI, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью картирования экспрессии белков с пространственным разрешением.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет уточнения локализации мишеней и паттернов их коэкспрессии.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени благодаря воспроизводимому мультиплексному детектированию белков в контексте ткани.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: предоставляет стандартизированные автоматизированные протоколы иммунофлуоресценции для согласованного выбора ROI в рабочих процессах протеомики.
- Количественный результат: генерирует измеряемые белковые сигналы из определенных областей ткани для оценки воздействия соединений.
- Повторное использование платформы: облегчает замену маркеров для адаптации панелей под различные задачи пространственной протеомики в разных проектах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: демонстрирует выявление специфических популяций клеток в малых областях интереса (ROI, 50 µm), что способствует профилированию с учетом биомаркеров.
- Прогресс с учетом рисков: позволяет проводить профилирование обогащенных типов клеток для обоснования выбора и валидации доклинических моделей.
- Механистическое снижение рисков: связывает пространственную экспрессию белков с функциональными отделами ткани для улучшения валидации мишеней.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, позволяя осуществлять выбор области интереса (ROI) на основе выдвинутых гипотез до этапа идентификации лидов, при этом полученные результаты используются в аналитике для приоритизации мишеней.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей с помощью пространственно-разрешенного мультиплексного анализа белков.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели содержания белков в стандартизированных областях интереса (ROI) для надежного проведения анализа.
- Аналитика: предоставляет нормализованные показатели экспрессии белков из определенных областей для возможности сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклинической работой посредством профилирования специфических популяций клеток в пространственно-разрешенной ткани.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного использования автоматизированной стандартизированной визуализации для нескольких протеомных панелей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней за счет воспроизводимого мультиплексного детектирования белков.
- Операционная ценность: Стандартизация и масштабируемость благодаря использованию автоматизированной платформы и валидированных протоколов.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет снижения неопределенности в механизмах биологии мишени.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе данных о пространственном распределении экспрессии мишени.
Особенности реализации
- Опыт в разработке методов иммунофлуоресцентного анализа и работе с автоматизированными платформами окрашивания.
- Доступ к системам автоматического окрашивания с возможностью тирамидной амплификации сигнала.
- Стандартизация панелей антител и условий блокирования между исследовательскими группами.
- Особенности адаптации при замене маркеров для сохранения целостности сигнала.
- Ограничение: протокол несовместим с методами пространственной транскриптомики из-за interference с детекцией РНК.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:44
Automated Visualization Protocol for Spatial Proteomics Assays
6:02
Spatial Profiling Platform Protocol for Proteomics Assay
6:47
ROI Selection for Spatial Transcriptomics Assays
7:10
Results: Application of the Automated TSA Based Visualization Protocol in Combination with Spatial Proteomics Assays and Detection of Small ROIs in the Spatial Transcriptomics Protocol
8:47
Conclusion
