Выделение врожденных лимфоидных клеток матки для анализа методом проточной цитометрии

Это метод выделения лимфоидных клеток матки как от беременных, так и от небеременных мышей. Этот метод может быть использован для нескольких последующих приложений, таких как фенотипирование FACS, сортировка клеток, функциональные анализы, РНК-seq и протеомика. Протокол здесь демонстрирует, как фенотип группы 1 врожденных лимфоидных клеток матки методом проточной цитометрии.

Наш метод позволяет оценить состав и функциональные характеристики различных субпопуляций лимфоцитов, присутствующих в ткани матки беременных и небеременных животных. Этот протокол позволяет выделять лимфоциты матки при сохранении поверхностной экспрессии белка, жизнеспособности и функциональности клеток. Поэтому он подходит для целого ряда последующих применений.

Удаление плода в начале эксперимента и сбор лейкоцитов являются технически сложными этапами. Поскольку это длительный эксперимент, особое внимание и фокус необходимы, как только вы достигнете этапов окрашивания антител. Для начала перенесите ткань матки, собранную у беременной черной шестиженской мыши C57, в стерильную чашку Петри, затем с помощью стерильных инструментов аккуратно удалите жир, окружающий ткань, заботясь о том, чтобы ткань не высохла.

Удалите плоды, рассекая каждый участок имплантации стерильными инструментами, а затем верните матку в ее первоначальную пятимиллилитровую сборную трубку, содержащую один миллилитр коллекционной среды. С помощью ножниц измельчите ткань в трубке для сбора, затем поместите трубку на водяную баню с температурой 37 градусов цельсия. Затем добавьте в трубку три миллилитра предварительно подогретой ферментативной смеси для пищеварения.

Инкубировать в пробирке в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия с перемешиванием для усиления ферментативной активности пищеварения. После того, как инкубация завершена, вихрьте трубку и держите ее на льду, чтобы ингибировать ферментативную активность, а затем переместите пищеварительную ткань в правильно маркированную 15-миллилитровую центрифужную трубку. Промыть пятимиллилитровую коллекторную трубку в общей сложности 10 миллилитрами ледяного холодного пятимилмилярного раствора EDTA PBS, чтобы собрать всю оставшуюся ткань и перенести ее в 15-миллилитровую центрифужную трубку.

Центрифугируйте переваренный образец ткани в течение 10 минут в 400 раз больше G.Отбросьте надосадочный агент, осторожно щелкните гранулой, а затем повторно суспендируйте в 10 миллилитрах предварительно нагретого пятимиллимолярного раствора ЭДТА PBS. Чтобы уменьшить слипание клеток, инкубируют образец при 37 градусах Цельсия с перемешиванием с последующим вихрем на высоте в течение 10 секунд. Для удаления клеточных сгустков в неассоциированной ткани поместите 70-микрометровый ситечко поверх стерильной 50-миллилитровой центрифужной трубки, затем, используя поршень стерильного шприца длиной в один миллилитр, нажмите переваренную ткань через ситечко в трубку.

Промыть ситечко несколько раз с общим количеством 10 миллилитров холодного PBS, чтобы собрать все клетки, затем проведите 50-миллилитровую центрифужную трубку в течение 10 минут в 400 раз G. После выброса супернатанта врожденные лимфоидные клетки могут быть выделены с использованием либо варианта A, либо варианта B.Для варианта A повторно суспендируйте гранулу в пять миллилитров 80% изотонического на вызов с использованием pipette voy. Затем, используя пипетку voy на медленной скорости, аккуратно накладывайте восемь миллилитров, 40% на раствор вызова, на повторно суспендированную гранулу в 15-миллилитровой центрифужной трубке. Пипетка медленно и непрерывно, удерживая 15 миллилитр примерно под углом 45 градусов.

Не нарушая накладки, центрифугируйте трубку в течение 20 минут при 850 G со средним ускорением и минимальными разрывами при комнатной температуре. После завершения центрифугирования осторожно извлеките трубку из центрифуги, не нарушая слои на вызов. Затем, не нарушая кольцо лейкоцитов на границе раздела двух растворов на вызов, используйте стерильную пастеровую пипетку, чтобы выбросить все, кроме 0,5-одного миллилитра верхнего слоя на вызов.

Стараясь свести к минимуму количество засасываемого в пипетку раствора на один вызов, тщательно соберите кольцо лейкоцитов и перенесите клетки в новую меченую 15-миллилитровую центрифужную трубку. Добавьте к клеткам 10 миллилитров стерильной среды RPMI, дополненной 10% теплом и активированным FBS, затем центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 500 G и четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант и приступайте к лизису эритроцитов.

Чтобы изолировать клетки с использованием варианта В, после пропускания переваренной ткани через клеточный ситечко и центрифугирования результата в клеточной суспензии, как показано ранее, повторно суспендируют гранулу с восемью миллилитрами 35% изотонической на вызов и RPMI-среду и переносят клетки в 15-миллилитровую трубку. Центрифугируйте трубку в 940 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре со средним ускорением и минимальными перерывами. Затем, используя аспиратор или пипетку voy, тщательно аспирируйте супернатант перед повторным использованием гранулы в 14 миллилитрах среды RPMI, дополненной 10% теплом и активированной FBS.

Снова центрифугируйте образец в течение пяти минут при 500 G и четырех градусах Цельсия, затем выбросьте супернатант путем аспирации и приступайте к лизису эритроцитов. Чтобы лизировать эритроциты, повторно суспендируйте образец в трех миллилитрах одного раствора для лизирования эритроцитов X и инкубируйте в течение трех минут при комнатной температуре, затем добавьте 10 миллилитров PBS в образец, чтобы остановить реакцию. Центрифугируйте трубку в 400 раз G в течение пяти минут после выброса супернатанта, добавьте еще 10 миллилитров PBS и повторите центрофугирование.

Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре среды RPMI, дополненной 10% инактивированным теплом FBS, затем пропускают внутриклеточную суспензию через стерильный 70-микрометровый клеточный сетчатый фильтр. После подсчета клеток корректируют концентрацию клеточной суспензии до одного-2 миллионов клеток в 100 микролитрах PBS и приступают к окрашиванию и анализу facs. ILC первой группы матки включают обычные NK-клетки, тканевые резидентные NK-клетки и ILC первой группы с их процентами, изменяющимися в течение жизни и беременности.

Эти подмножества могут быть дискриминированы с помощью проточной цитометрии путем сначала определения их способности рассеивать свет, затем выделения одного покупаемого CD 45 положительного CD трех отрицательных CD 19 отрицательных клеток, а затем идентификации ILC первой группы, которые являются NK 1.1 и NKP 46 положительными. В пределах ILC первой группы CD49A отрицательные EM положительные являются обычными NK-клетками. CD49A-положительные Ems-положительные клетки являются тканевыми резидентными NK-клетками.

А CD49 положительные Ems отрицательные клетки относятся к ILC матки первой группы. Окрашивание селезеночных и маточных лимфоцитов антителами против NK P46 и против NK 1.1 показывает, что селезеноциты экспрессируют более высокое количество NKP 46 на своей поверхности, чем их маточный аналог. При диссоциации ферментативной ткани поверхностные эпитопы могут быть изменены в зависимости от ферментов, используемых в среде пищеварения.

Например, окрашивание для рецептора MHC CD49 NKG2A является плохим при использовании либеразы TM. Однако пищеварение с либеразой DH сохраняет распознавание NKG2A клоном антитела 1611. Около 6,5% ILC первой группы, присутствующих в образцах тканей матки на 8,5-й день беременности, получены из крови.

Загрязнители крови могут быть исключены путем прижизненного окрашивания антителами против CD45, конъюгированными с фторхромом. При настройке временных встреч вы должны учитывать, что мыши ведут ночной образ жизни. Поэтому их следует устанавливать как можно позже во второй половине дня, так как спаривание будет происходить ночью.

Также при подборе самок необходимо следить за тем, чтобы у них не было вагинальной перегородки. Обычно мы проводим анализ проточной цитометрии, чтобы посмотреть на многие белки снаружи клеток и внутри клеток. Мы также экстракционируем нуклеиновые кислоты для изучения экспрессии генов, включая секвенирование РНК.

И нам также удается обойти функциональные анализы для изучения реакций врожденных лимфоидных клеток матки.