Эксперименты ямР высокого давления для обнаружения белковых низколежащих конформационных состояний
29 июня 2021 г.
Мы предоставляем подробное описание этапов, необходимых для сборки ячейки высокого давления, настройки и записи экспериментов с ЯМР высокого давления и, наконец, анализа как пиковой интенсивности, так и изменений химического сдвига под давлением. Эти эксперименты могут дать ценную информацию о путях сворачивания и структурной стабильности белков.
Высокое давление — это метод выбора для изменения относительной популяции белкового конформационного образца. Он чрезвычайно полезен для выделения и характеристики высокоэнергетических конформационных состояний. По сравнению со всеми методами возмущения, такими как pH или температура, возмущение давления легко применяется и полностью обратимо.
Это также локальное возмущение, в первую очередь поражающее области со стеклянными полостями или объемами пустоты. Для начала введите образец с маркировкой азота-15 в циркониевую трубку с помощью стеклянной пипетки и убедитесь, что образцы сидят в нижней части трубки. Чтобы предотвратить смешивание образца с трансмиссионной жидкостью, наложите на образец 200 микролитров минерального масла, а затем заполните остальную часть трубки трансмиссионной жидкостью.
Положите одноразовое уплотнительное кольцо поверх циркониевой трубки и сдвиньте трубку в основание. Затем подключите трубку к линии троса высокого давления и вручную затяните основание к ячейке. Затем примените крутящий момент 14,7 ньютон-метров для предотвращения утечек при более низком давлении.
Чтобы проверить целостность ячейки давления в сборе, нажмите трубку до 300 бар вне спектрометра с помощью ячейки поддержки и защитного сосуда. Через 15 минут сбросьте давление до одного бара и проверьте наличие утечек с помощью чистой безворсовой салфетки. Вставьте трубку без давления в спектрометр, осторожно направляя линию троса.
Вставьте трубку в спектрометр до тех пор, пока трубка не достигнет положения образца сидя. Запирайте, прокладывайте, сопоставляйте и настраивайте протоевые и азотные каналы и сохраняйте оптимизированные прокладки для будущего. Настройте поперечную релаксационную оптимизированную спектроскопию с гетеро-одноквантовой когерентной спектроскопией и приступайте к записи эталонного эксперимента в атмосферных условиях.
Запишите серию 2D-экспериментов от одного бара до 2,5 килобар на каждые 500 баров. Если известны точные скорости складывания или разворачивания, после каждого 500-барного приращения пусть образец уравновешивается в течение 15-20 минут. Когда точка перегиба складного или разворачивающегося перехода достигает, запишите дополнительные эксперименты, чтобы повысить точность подгонки.
Этот протокол был использован для исследования зависимости давления RRM2, второго мотива распознавания РНК гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина A1. Поперечная релаксационная оптимизированная спектроскопия с гетеро-одноквантовой когерентной спектроскопией была собрана при одном баре, 1,5 килобарах, двух килобарах и 2,5 килобарах. RRM2 почти полностью развернут в диапазоне 2,5 килобар. Отдельные профили интенсивности давления были установлены в соответствии с уравнением, показанным здесь, для получения соответствующих изменений в стандартной свободной энергии и объеме Гиббса, связанных с разворачивающейся реакцией.
При нанесении на карту доменной структуры остатки с наибольшей величиной изменения объема были обнаружены в структурном ядре домена, в то время как остатки с наименьшей величиной изменения объема были в основном расположены в соединительных петлях между бета-нитями и бета-нитями к концевой спирали C. Для исследования степени сжимаемости и конформационной неоднородности ансамбля складчатого состояния были проанализированы химические сдвиги протия. Отдельные профили химических сдвигов протия в зависимости от давления были установлены с использованием показанного уравнения для извлечения линейных и нелинейных коэффициентов для конкретного участка.
Остатки с наибольшими нелинейными коэффициентами были в основном обнаружены в структурном ядре домена, в то время как остатки с наименьшими нелинейными коэффициентами были в основном расположены внутри петель, соединяющих различные структурные мотивы. Важно правильно настроить трубку как напорную установку, чтобы предотвратить утечки. Если произойдет утечка, зонд, вероятно, придется удалить, чтобы очистить любые следы минерального масла.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описываются сборка ячейки высокого давления и подготовка к экспериментам по ЯМР при высоком давлении. Особое внимание уделяется анализу интенсивности пиков и изменений химического сдвига под давлением, что позволяет получить сведения о путях фолдинга белков и их структурной стабильности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Структурная биология
Теоретические основы
- Высокое давление изменяет конформационные состояния белков.
- Это метод обратимого воздействия.
- Давление воздействует преимущественно на области с наличием пустот.
- Полезно для характеристики высокоэнергетических конформационных состояний.
Цель исследования
- Описать этапы сборки ячейки высокого давления.
- Организовать и провести эксперименты по ЯМР при высоком давлении.
- Проанализировать влияние давления на структуру белков.
Используемые методы
- Внесение образцов, меченных изотопом азота-15, в циркониевую трубку.
- Покрытие образцов минеральным маслом для предотвращения перемешивания.
- Заполнение трубки передающей жидкостью.
- Регистрация экспериментов ЯМР при высоком давлении.
Основные результаты
- Подробная методика настройки ЯМР высокого давления.
- Представления о путях фолдинга белков.
- Анализ интенсивности пиков и изменений химического сдвига.
- Характеристика структурной стабильности под давлением.
Выводы
- ЯМР высокого давления эффективен для изучения динамики белков.
- Метод позволяет получить ценные сведения о конформационных состояниях белков.
- Данная методология может быть применена при изучении различных белков.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
ЯМР высокого давления позволяет биофармацевтическим группам исследовать низкозаселенные высокоэнергетические конформационные состояния, имеющие решающее значение для понимания фолдинга, стабильности и олигомеризации белков. Эта возможность повышает прогностическую уверенность при валидации мишени и снижает риски на ранних этапах разработки, раскрывая механистические детали, недоступные для стандартных методов пертурбации. Интеграция ЯМР под давлением в рабочие процессы поиска лекарств способствует более обоснованному отбору проектов в портфеле и принятию решений о продвижении кандидатов с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую наблюдать редкие конформационные состояния, имеющие значение для функциональной валидации мишени.
- Способствует снижению механистических рисков путем картирования сайт-специфической стабильности и переходов фолдинга.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишени за счет количественной оценки локальной и глобальной стабильности белка.
Скрининг и разработка анализа
- Облегчает подготовку валидированных белковых систем для последующего скрининга путем характеристики равновесия фолдинга и олигомеризации.
- Обеспечивает количественные данные с разрешением по активным центрам для стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Позволяет проводить надежное сравнение вариантов белков или эффектов лигандов при контролируемом воздействии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные о структурной стабильности с механизмами неправильного сворачивания или агрегации белков, имеющими значение для заболевания, где это применимо.
- Обеспечивает преемственность этапов от открытия до доклинической валидации, предоставляя информацию о конформационной неоднородности и сжимаемости.
- Снижает риски при трансляционном переходе за счет выявления биофизических недостатков на ранних этапах разработки.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
ЯМР высокого давления встраивается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, предоставляя платформу для обратимого количественного воздействия с целью характеристики белков.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о механизмах фолдинга и равновесиях олигомеризации.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные измерения конформационных переходов для разработки анализов.
- Аналитика: позволяет получать профили интенсивности и химического сдвига для конкретных сайтов с целью сравнения структурных состояний.
- Трансляционные исследования: дает информацию о конформационной гетерогенности, имеющей значение для моделей заболеваний, при наличии соответствующей белковой системы.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет возможность повторного использования аналитического метода для различных белковых мишеней и изучения различных механизмов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации белковых мишеней.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, обратимое и масштабируемое воздействие для получения воспроизводимых данных.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления структурных недостатков.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации и продвижению белковых мишеней с учетом рисков на основе надежных биофизических данных.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области ЯМР-спектроскопии и приборов для работы при высоком давлении.
- Необходимым является специализированное оборудование, включая ячейки высокого давления и системы герметизации.
- Требуется строгое соблюдение протоколов подготовки образцов и предотвращения утечек.
- Может потребоваться адаптация метода для различных белковых систем или стратегий мечения.
- Операционные ограничения включают диапазон давления и время уравновешивания для получения точных измерений.
