Рассечение планарийных яичников для ультраструктурного анализа и окрашивания антителами
10 сентября 2021 г.
В этом протоколе представлены шаги, предпринятые для вскрытия яичников у пресноводных планарий, Schmidtea mediterranea. Препарированные яичники совместимы для иммуноокрашивания антителами и ультраструктурного анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии для изучения клеточной биологии ооцитов и соматических клеток, обеспечивая глубину и качество визуализации, которые ранее были недоступны.
Целью данного метода является препарирование яичников планарии Schmidtea mediterranea для клеточного и субклеточного анализа биологии ооцитов с помощью ПЭМ или окрашивания антителами. В этом протоколе используется короткий этап фиксации для облегчения локализации и рассечения планарных яичников, что обеспечит глубину и качество визуализации, которые ранее были недоступны. Самой большой проблемой для того, кто никогда раньше не выполнял эту методику, будет локализация яичников после фиксации.
Будет полезно ознакомиться с анатомией половых планарий перед экспериментом. Подготовьтесь к эксперименту, кормя половых планарий органической печеночной пастой два раза в неделю для достижения половой зрелости. Обрабатывайте половозрелых червей 5%-ным N-ацетил-L-цистеином, или NAC, в чашке комнатной температуры в течение пяти минут.
Замените NAC на 10 миллилитров свежеприготовленного 4%-ного параформальдегида, и зафиксируйте червей на один час при комнатной температуре с периодическим встряхиванием. Начните вскрытие через 10 минут после добавления 4% параформальдегида по мере фиксации червей. Обратите внимание на пигментацию эпителия, чтобы найти вентральные нервные канатики, которые выглядят как две линии с более светлой пигментацией, идущие от передних головных ганглиев к хвосту.
Определите местонахождение предполагаемых яичников, наблюдая за пигментацией, и подтвердите их положение. С помощью двух хирургических ножей сделайте надрезы сзади и спереди от яичников, чтобы полностью удалить передние и задние фрагменты червей. Используйте один нож для закрепления червя, а другой нож для вскрытия.
Очистите нож, которым сделаны надрезы. Чтобы разделить две завязи, разрежьте по средней линии фрагмент завязи, затем переверните фрагмент вентральной стороной вниз. Используйте две пары остроконечного пинцета типа 5-SA, чтобы отклеить дорсальную ткань, чтобы обнажить кишечник.
Аккуратно удалите ветки кишки, расположенные над вентральными тканями, с помощью кончика пинцета или мягкой щетки, чтобы обнажить завязь. Удалите окружающие ткани, чтобы удалить яичник. Выньте яичники и переложите их в 1,5-миллилитровую трубку, чтобы промыть 1 миллилитром PBS.
Дорсальная и вентральная пигментация была использована для определения положения яичников. Излишки ткани были обрезаны поэтапно. Как только яичник обнажался, окружающие ткани обрезались.
Яичники, содержащие несколько типов соматических клеток, использовались как для ультраструктурного анализа, так и для иммунофлуоресцентного окрашивания. Рассеченные яичники позволяют получить высококачественную визуализацию клеточной и субклеточной анатомии ооцитов. Эта процедура должна позволить проводить эксперименты по РНК-интерференции для изучения молекулярной регуляции биологии ооцитов.
Этот метод привел к открытию нового явления в ооцитах плоского червя, заключающегося в том, что ядерная оболочка распадается на пузырьки, инкапсулирующие ядерные белки, вместо того, чтобы оставаться нетронутыми, что называется закрытым митозом, или распадается на части, что является открытым митозом.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описана процедура препарирования яичников пресноводной планарии Schmidtea mediterranea, направленная на обеспечение возможности клеточного и субклеточного анализа биологии ооцитов. Этот метод повышает качество и глубину визуализации за счет использования таких методов, как просвечивающая электронная микроскопия (TEM) и иммуноокрашивание антителами.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Анализ ооцитов
- Биология планарий
Теоретические основы
- Анатомия половозрелых планарий имеет решающее значение для эффективного препарирования.
- Скармливание планариям органической пасты из печени способствует достижению половой зрелости.
- Яичники локализуют по характеру пигментации эпителия.
Используемые методы
- Методы хирургической диссекции
- Пресноводная планария Schmidtea mediterranea
- Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и иммунофлуоресцентное окрашивание
Основные результаты
- Эффективная локализация и диссекция яичников половых планарий.
- Высококачественная визуализация клеточных структур и типов соматических клеток.
- Метод поддерживает эксперименты по РНК-интерференции для изучения молекулярной регуляции.
Выводы
- В данном исследовании представлен новый метод анализа репродуктивных клеток планарий.
- Эта работа расширяет понимание биологии ооцитов и создает базу для будущих генетических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Прямой доступ к неповрежденным яичникам планарий позволяет проводить анализ развития половых клеток с высоким разрешением, что способствует снижению рисков при механистическом подтверждении на ранних этапах исследований. Данный протокол облегчает количественную визуализацию и молекулярное исследование биологии ооцитов, повышая прогностическую достоверность исследований зародышевой линии. Этот подход предназначен для валидации мишеней и функциональной геномики в рамках рабочих процессов по изучению репродуктивной биологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность точного изучения развития половых клеток и процессов мейоза.
- Поддерживает функциональную валидацию генных пертурбаций с помощью РНК-интерференции в ооцитах.
- Повышает понимание механизмов для выбора репродуктивных мишеней и снижения рисков.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную подготовку целых яичников для последующей визуализации и анализов с использованием антител.
- Способствует воспроизводимому количественному анализу клеточных и субклеточных структур.
- Позволяет проводить надежную оценку функции генов в контролируемых экспериментальных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, значимым для изучения эпигенетики зародышевой линии и клеточной архитектуры при патологиях.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации репродуктивных мишеней.
- Предоставляет прогностические данные о консервативных механизмах биологии ооцитов.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол диссекции интегрируется в этапы раннего поиска и валидации мишеней, обеспечивая возможность последующего ультраструктурного анализа и иммуноокрашивания. Он поддерживает рабочие процессы от проверки гипотез до оценки функций генов в зародышевых системах.
- Фундаментальная биология: Облегчает проведение исследований по спецификации половых клеток и регуляции мейоза на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: Обеспечивает получение готовой к анализу ткани яичников для количественной визуализации и скрининга антител.
- Аналитика: Предоставляет данные клеточного и субклеточного уровней с высоким разрешением для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Связывает фундаментальные открытия с доклинической оценкой репродуктивных мишеней.
- Повторное использование в организации: Устанавливает воспроизводимый протокол для различных исследований зародышевой линии и пертурбаций генов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает неоднозначность при валидации мишеней в зародышевых клетках.
- Операционная ценность: стандартизирует процессы диссекции яичников и визуализации для обеспечения воспроизводимости.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований (go/no-go) в портфелях по репродуктивной биологии.
- Влияние на портфель: способствует приоритезации мишеней зародышевой линии и исследований функций генов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области анатомии планарий и методов диссекции.
- Необходим доступ к оборудованию для трансмиссионной электронной микроскопии и инфраструктуре для иммуноокрашивания.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости подготовки тканей и визуализации.
- Может потребоваться адаптация для других беспозвоночных или модельных систем зародышевой линии.
- Метод ограничен малым количеством и глубоким расположением ооцитов планарий.
