Исследование развития дендритных клеток с помощью короткого шпильки РНК-опосредованного нокдауна гена в кроветворном стволе и клеточной линии-предшественника in vitro
7 марта 2022 г.
Здесь мы предоставляем протокол для скрининга потенциальных факторов транскрипции, участвующих в развитии дендритных клеток (DC), с использованием лентивирусной трансдукции шРНК для получения стабильных нокдаун клеточных линий для дифференцировки dc in vitro .
Дендритные клетки, или ДК, являются ключевыми иммунными клетками, связывающими врожденную и адаптивную иммунную систему. Хотя DC неоднородны, этот метод помогает нам понять, какие гены, включая факторы транскрипции, могут регулировать развитие DC. Этот метод обеспечивает простой и быстрый способ идентификации гена, который контролирует развитие DC от их прародителя in vitro.
Для начала поддерживайте увековеченные гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки или iHSPC в полной среде RPMI 1640, дополненной 100 нанограммами на миллилитр лиганда FLT3 и одним микромолярным бета-эстрадиолом. Для лентивирусной трансдукции пластинчат iHSPC в 12 луночных пластинах с плотностью от одного раза 10 до пятой клетки на лунку и один миллилитр полной среды, содержащей лиганд FLT3, бета эстрадиол и полибрен. Затем добавьте лентивирус, несущий короткую РНК шпильки в каждую лунку при множественности инфекции 100.
Затем раскрутите пластину в 1100 раз г и 37 градусов цельсия в течение 90 минут, затем инкубируйте зараженные клетки на ночь при 37 градусах Цельсия. На следующий день удалите полибрен, собрав клетки в 15 миллилитровые трубки при центрифугировании, после замены среды свежей полной средой, содержащей лиганд FLT3 и бета-эстрадиол. Через дополнительные 24 часа добавьте шесть микрограммов на миллилитр пуромицина в среду, чтобы отобрать инфицированные клетки.
Заменяйте селекционную среду каждые три дня и поддерживайте клетки в течение не менее одной недели, чтобы расширить стабильно трансдуцированные iHSPC. Генерировать и поддерживать стабильные нокдаунные iHSPC для LacZ, Tcf4 и Id2 в полной среде, дополненной лигандом FLT3 и бета-эстрадиолом. Чтобы инициировать дифференцировку in vitro, соберите недифференцированные iHSPC в 15-миллилитровые трубки и гранулируйте клетки центрифугированием.
После центрифугирования выбросьте супернатант и дважды промыть клетки 10 миллилитрами PBS. После второй промывки повторно суспендируют клетки в полную среду, содержащую только лиганд FLT3, затем высевают их с плотностью в два раза 10, чтобы пятый продавался на миллилитр в 12-луночную пластину. Через три дня добавить один миллилитр свежей полной среды, содержащей лиганд FLT3.
Через дополнительные два дня приступайте к анализу дифференцированных клеток методом проточной цитометрии. Для проточного цитометрического анализа пипеткой клетки вверх и вниз два-три раза в пластине, а затем собирают клетки в трубки по 1,5 миллилитра. Центрифугируйте трубки и выбросьте супернатант перед повторным использованием ячеек в 50 микролитрах факсимильного буфера.
Затем добавьте 50 микролитров анти-CD16 на 32 гибридомы супернатанта и инкубируйте в течение пяти-10 минут на льду. Затем добавьте флуоресцентные краситель-конъюгированные антитела непосредственно к клеткам и высиживайте в течение 15 минут на льду в темноте. После инкубации промыть клетки одним миллилитром факсимильного буфера и центрифугировать образец.
После центрифугирования повторно суспендируют ячейки в 100 микролитрах факсимильного буфера и анализируют образцы методом проточной цитометрии. После короткого нокдауна LacZ, Tcf4 и Id2 в iHSPCS, подтверждение эффективности нокдауна с помощью RTQ-PCR показало, что экспрессия нокдаун iHSPC Tcf4 и Tcf4 была снижена по сравнению с таковой в нокдаунных iHSPC LacZ. Аналогичные результаты наблюдались для выражения Id2 в нокдаунных iHSPC Id2.
После культивирования LacZ нокдаун iHSPC в течение пяти дней частота CD11c-положительных клеток, которые представляют собой популяцию дендритных клеток, составила около 95%Однако сбивание Tcf4 или Id2 немного уменьшило генерацию CD11c-положительных дендритных клеток. Дальнейший анализ CD11c-положительных дендритных клеток, полученных из нокдаунных iHSPC LacZ, показал, что 70% были обычными дендритными клетками, а 22% были плазмацитоидными дендритными клетками. Нокдаун iHSPC Tcf4 генерировал значительно более низкий процент плазмоцитоидных дендритных клеток, которые контролирует нокдаун LacZ.
Напротив, нокдаун iHSPC Id2 генерировал значительно более низкий процент обычных дендритных клеток, чем контроль нокдауна LacZ, но более высокий процент плазмоцитоидных дендритных клеток. Спиновые инфекции повышают эффективность трансдукции лентивирусно-несущей шРНК в iHSPC. Этот метод рассматривает роль факторов транскрипции и облегчает изучение других генов в передаче сигналов цитокинов или метаболизме, которые, вероятно, будут участвовать в развитии DC.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол скрининга транскрипционных факторов, влияющих на развитие дендритных клеток (ДК), посредством лентивирусной трансдукции шРНК. Данный метод позволяет создавать стабильные клеточные линии с нокдауном для дифференцировки ДК in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Транскрипционная регуляция
Введение
- Дендритные клетки играют ключевую роль в связывании врожденного и адаптивного иммунитета.
- Изучение развития дендритных клеток позволяет глубже понять механизмы иммунного ответа.
- Данное исследование сосредоточено на идентификации генов, регулирующих дифференцировку дендритных клеток.
- В методе используются иммортализованные гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники.
Цель исследования
- Разработать протокол скрининга транскрипционных факторов в процессе развития дендритных клеток.
- Создать стабильные клеточные линии с нокдауном для функциональных исследований.
- Обеспечить дифференцировку дендритных клеток из клеток-предшественников in vitro.
Используемые методы
- Поддержание иHSPCs в полной среде RPMI 1640.
- Добавление лиганда FLT3 и бета-эстрадиола.
- Лентивирусная трансдукция иHSPCs с использованием shRNA.
- Использование полибрена для повышения эффективности трансдукции.
Основные результаты
- Успешное создание стабильных клеточных линий с нокдауном генов.
- Идентификация транскрипционных факторов, участвующих в развитии дендритных клеток.
- Демонстрация способности к дифференцировке in vitro.
- Представление новых данных о генной регуляции развития иммунных клеток.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения развития дендритных клеток.
- Он может быть использован для идентификации ключевых регуляторных генов в иммунологии.
- Этот подход может способствовать более глубокому пониманию иммунных ответов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет систематически исследовать функцию факторов транскрипции в процессе определения линейной принадлежности дендритных клеток, что способствует валидации мишеней в программах открытий, ориентированных на иммунологию. Связывая генетическую пертурбацию с фенотипическим результатом в воспроизводимой системе in vitro, этот подход обеспечивает механическое снижение рисков для гипотез о мишенях на ранних стадиях. Данный метод повышает прогностическую точность при приоритизации иммуномодулирующих мишеней перед ресурсозатратными этапами идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает возможность функционального анализа транскрипционных факторов как потенциальных терапевтических мишеней в процессе развития дендритных клеток.
- Практическая ценность: предоставляет масштабируемую платформу для скрининга нокдауна с использованием лентивирусной доставки shRNA в иммортализованных гемопоэтических предшественниках.
- Прогностическая ценность: связывает модуляцию мишени с выходом подмножеств дендритных клеток, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейших исследований на основе данных о переключении линий дифференцировки.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные проточной цитометрии о CD11c-положительных клетках и распределении их подмножеств (cDC в сравнении с pDC) после нокдауна транскрипционных факторов.
- Практическая ценность: устанавливает стандартизированный метод анализа дифференцировки с определенными условиями применения цитокинов (лиганд FLT3, бета-эстрадиол) и селекцией с помощью пуромицина.
- Готовность анализа: обеспечивает создание стабильных клеточных линий с нокдауном, подходящих для многократного использования при скрининге соединений или в исследованиях по модуляции сигнальных путей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Моделирует раннюю спецификацию дендритных клеток из предшественников, что позволяет определять стратегии поиска биомаркеров, связанных с сетями транскрипционных факторов.
- Снижение механистических рисков: Разъясняет роль Id2 в стимулировании формирования обычных дендритных клеток и Tcf4 в поддержке развития плазмоцитоидных дендритных клеток.
- Доклиническое соответствие: Облегчает оценку мишеней, влияющих на дифференцировку иммунных клеток, что актуально для программ разработки адъювантов вакцин или лечения аутоиммунных заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод относится к этапу поисковой биологии (discovery biology), позволяя проверять гипотезы относительно мишеней перед разработкой анализа для идентификации ведущих соединений, при этом полученные данные используются при выборе доклинических кандидатов для иммуномодуляции.
- Открытия в биологии: Оказывает поддержку в механистическом анализе транскрипционных регуляторов, управляющих определением линии дендритных клеток из гемопоэтических предшественников.
- Разработка анализов: Позволяет получать воспроизводимые количественные конечные точки методом иммунофлуоресценции и проточной цитометрии для мониторинга эффективности дифференцировки и распределения подмножеств.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели (процент CD11c+, cDC, pDC), которые позволяют проводить сравнение между условиями нокдауна и поддерживают статистическую оценку влияния мишени.
- Трансляционные исследования: Связывает дифференцировку ранних предшественников с последующей иммунной функцией, что актуально для моделирования ответов при инфекциях или в условиях толерантности.
- Повторное использование в масштабах организации: Создает многократно используемую платформу для скрининга дополнительных генов в путях цитокинового сигналинга, метаболизме или транскрипционных сетях, влияющих на развитие дендритных клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в валидации мишени за счет установления связи между нокдауном транскрипционного фактора и измеримыми изменениями в генерации субпопуляций дендритных клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию протоколов дифференцировки и считывания результатов между лабораториями за счет определенного состава сред и селективных маркеров.
- Стратегическая ценность: снижает биологические риски при выборе иммуномодулирующих мишеней, предоставляя ранние функциональные доказательства эффектов, специфичных для конкретной линии клеток.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе их влияния на определение судьбы дендритных клеток, что способствует эффективному распределению ресурсов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с лентивирусной трансдукцией, культивированием гемопоэтических клеток и проточной цитометрией.
- Необходим доступ к библиотекам лентивирусных shRNA, пуромицину для селекции и средам с добавлением цитокинов (лиганд FLT3, бета-эстрадиол).
- Необходима стандартизация эффективности трансдукции (например, путем центрифугирования при инфицировании) и продолжительности селекции для создания линий со стабильным нокдауном.
- Требуется оптимизация времени дифференцировки и панелей антител для точной идентификации подмножеств дендритных клеток методом проточной цитометрии.
- Метод ограничен моделированием in vitro; полученные результаты требуют валидации на первичных человеческих или мышиных системах для подтверждения трансляционной значимости.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
