Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae

Этот протокол предназначен для определения постохондриальной локализации дрожжевых митохондриальных белков, которая рассматривается как фундаментальный этап при выяснении функции митохондриального белка. Протокол подходит для наших штаммов дрожжей, поддерживаемых в различных условиях роста. Представляя собой мощный инструмент для исследований, как изучение митохондрий.

Начнем с того, что клетки из запаса глицерина, хранящегося при 80 ° C, попадают на агаровую пластину YPD, чтобы изолировать отдельные колонии от интересующего штамма. И высиживать пластину при 30 С в течение 2 - 3 дней. Приготовьте закваску, инокуляя от 2 до 3 отдельных колоний из агаровой пластины YPD в колбу Эрленмейера объемом 100 мл, содержащую от 10 до 30 мл среды YPGal.

Инкубируйте колбу при 30 С в течение 24 часов с энергичным встряхиванием при 180-200 об/мин. Разбавляют закваски в 1 л свежей среды YPGal до оптической плотности менее 0,1 при 600 нм. Культивируют клетки при 30 С с энергичным встряхиванием при 180-200 об/мин в течение примерно 12 часов, пока оптическая плотность не достигнет от 1 до 1,5.

Выполняют выделение высокоочищенных митохондрий, как описано в тексте. И определить концентрацию белка высокоочищенного митохондриального препарата, используя анализ Брэдфорда, следуя инструкциям производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 10 мг/мл с помощью ледяного буфера SEM.

Переложите 40 л высокоочищенных митохондрий в четыре предварительно охлажденные и меченые микроцентрифужные трубки по 1,5 мл. Добавьте 360 л SEM-буфера в первую и вторую пробирки. И 360 л ЭМ-буфера в третьей и четвертой пробирках.

Используя схему пипетирования, согласно тексту, добавляют 4 л свежеприготовленной протеиназы К во вторую и четвертую пробирки. После осторожного перемешивания всех пробирок высиживать на льду в течение 30 минут с периодическим перемешиванием. Для остановки активности протеиназы К добавляют во все четыре пробирки 4 л 200 мМ PMSF.

Центрифугируйте пробирки по 20 000 х г в течение 30 минут при 4 С. И соберите супернатант, не нарушая гранулу, в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Затем повторно суспендируйте гранулу в 400 л ледяного SEM-буфера. Чтобы инактивировать возможные следы протеиназы К, осадите собранный супернатант и повторно суспендируйте гранулу трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 10%, инкубируйте пробирки на льду в течение 10 минут.

Центрифугируют обработанные трихлоруксусной кислотой образцы в течение 10 минут при 12 000 х г при 4 С. А после удаления супернатанта повторно суспендируют гранулу в 200 л буфера образца. Если бромфенол синий становится желтым, добавьте от 1 до 5 л основания 1 M Tris, пока оно не станет синим. Добавьте 4 л 200 мМ PMSF ко всем пробиркам.

Храните образцы при температуре 80 ° C до дальнейшего анализа с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Переложите 200 л высокоочищенных митохондрий в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разбавьте митохондрии в один раз ледяным буфером SEM.

Используя ультразвуковой аппарат, совместимый с небольшими объемами, обрабатывайте митохондрии ультразвуком 3 раза в течение 30 секунд на льду. Центрифугируйте образец в течение 30 минут при 100 000 х г при 4 С. И соберите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. После маркировки трубки как S" для растворимой белковой фракции держите трубку на льду.

Повторное суспендирование гранулы с предыдущей стадии в 400 л ледяного SEM-буфера. Переложите 100 л повторно суспендированной гранулы в новую пробирку предварительно охлажденной микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Пометьте трубку как SMP" для фракции постохондриальных частиц и держите трубку на льду.

Оставшиеся 300 л повторно суспендированных гранул раз разбавить свежеприготовленным 200 мМ карбонатом натрия. И высиживать разбавленный образец на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте образец в течение 30 минут при 100 000 х г при 4 С. Соберите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.

Пометьте образец как CS" для фракции карбонатного супернатанта и держите трубку на льду. Повторное суспендирование гранулы с предыдущей стадии в 400 л ледяного SEM-буфера. И назовите образец CP" для карбонатной осажденной фракции.

Осадите все образцы трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 10% и инкубируйте трубки на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируют образцы в течение 10 минут при 12 000 х г при 4 С. После удаления супернатанта повторно суспендируют каждую гранулу в буфере образца. Если буфер образца становится желтым, добавьте от 1 до 5 л основания 1 M Tris, пока оно не станет синим.

Добавьте 1 л 200 мМ PMSF ко всем пробиркам и храните при 80 ° C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Сырую митохондриальную фракцию очищали при центрифугировании градиента плотности сахарозы и наблюдалось уменьшение других клеточных загрязнений. Превращение митохондрий в митопласт контролировали исчезновением межмембранного космического белка цитохрома b2 в грануле.

С сопутствующим появлением в супернатанте. Опосредованная протеиназой К деградация межмембранного белка Sco1 наблюдалась из-за разрушения наружной мембраны осмотическим шоком. Целостность внешней митохондриальной мембраны была подтверждена защитой цитохрома b2 и Sco1 от деградации протеиназы K в гранулированной фракции.

Аналогичным образом, защита матриксного растворимого белка KGD подтвердила целостность внутренней митохондриальной мембраны. Профиль западного пятна Prx1 предполагал двойную митохондриальную локализацию в межмембранном пространстве и матрице. Митохондрии подвергали ультразвуковой обработке и карбонатной экстракции для исследования топологии мембранных белков.

Интегральная мембранная белковая заливка осталась в гранулированных фракциях. КГД был обнаружен в надводной фракции. Обнаружение белка KGD в гранулах было обусловлено изменениями параметров ультразвуковой обработки, влияющими на образование SMP.

После обработки карбонатом натрия KGD и фракцию SMP солюбилизировали и обнаружили в фракции надосадочных веществ. Профиль западного пятна Prx1 предполагает ассоциацию с периферией мембраны. Для успеха протокола индохондриального фракционирования важно остановить активность протеиназы К после гипотонического отека путем добавления PMSF в образцы.

Сайты предоставляют информацию о локализации белка субтохондрий. Этот протокол также может быть использован для проверки целостности митохондриальных препаратов, что является фундаментальным при протеомных исследованиях митохондриальных подкомпартментов.