Мультиплексированное флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание четырех типов иммунных клеток эндометрия при рецидивирующем выкидыше
4 августа 2021 г.
Несмотря на достижения в мультиплексной иммуногистохимии и мультиспектральной визуализации, характеристика плотности и кластеризации основных иммунных клеток одновременно в эндометрии остается проблемой. В этой статье описывается подробный протокол мультиплексного окрашивания и визуализации для одновременной локализации четырех типов иммунных клеток в эндометрии.
Настоящая технология позволяет использовать антитела, выращенные у одного вида, для обнаружения до семи маркеров. Продемонстрировать процедуру будет Лусия Чан, техник из лаборатории. Начните с подготовки формалиновых фиксированных парафиновых стеклянных слайдов, установленных вместе с образцом ткани, поместив слайды в духовку, чтобы выпекать при температуре 60 градусов цельсия с тканью, обращенной вверх.
Через час очистите воск и регидратируйте слайды в течение 10 минут каждый с серией химических веществ, как описано в рукописи. Погрузите слайды в трис-буферизованный физиологический раствор, а затем в пластиковую коробку для слайдов, заполненную смесью формальдегида, разбавленного в метаноле, чтобы зафиксировать образцы. Затем дважды промойте горки в деионизированной воде в течение двух минут.
Приступайте к извлечению эпитопов, поместив стойку слайдов в термостойкий ящик, заполненный буфером лимонной кислоты при рН 6,0. А затем поместите коробку в микроволновую печь, чтобы нагреть слайды сначала на 100% мощности в течение 50 секунд, затем 20 минут на 20% мощности, чтобы поддерживать ту же температуру. После промывки горок в дистиллированной воде и промывки TBST, погрузите горку в банку, содержащую раствор, блокирующий перекисное окисление, на 10 минут.
После инкубации промойте горки в дистиллированной воде и промойте TBST, затем используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы отметить границу вокруг участка ткани на слайде. Затем промойте горку в TBST, накройте участки тканей блокирующим буфером и высиживайте слайды в увлажненной камере в течение 15 минут. Чтобы удалить блокирующие реагенты, сначала инкубируют слайды с первичным антителом, представляющим интерес, а затем удаляют первичное антитело, промывая слайды трижды TBST, перед инкубацией с полимерной пероксидазой полимерного хрена, меченым вторичным антителом.
После инкубации промыть слайды перед нанесением опаловой флоры на рабочий раствор TSA, а затем промыть горку буфером извлечения антигена. Выполните зачистку на основе микроволновой печи, нагревая слайды в буфере извлечения антигена в микроволновой печи на 100% мощности в течение 50 секунд, а затем 20% мощности в течение 20 минут в контейнерах, безопасных для микроволновой печи. После охлаждения образцов при комнатной температуре в течение 15 минут промойте горки в дистиллированной воде и TBST, а затем инкубируйте с раствором dappy в течение пяти минут.
Затем высушите горку на воздухе перед монтажом с помощью соответствующего монтажного носителя. Перед созданием изображения слайдов предварительно установите соответствующие фильтры в рабочей станции. Захватите не менее 10 полей для анализа при 200-кратном увеличении.
Чтобы подсчитать ячейки, нажмите на кнопку подсчета объектов на панели шагов, чтобы отобразить панель настроек подсчета объектов. Если ткань сегментирована, выберите категорию тканей, в которой объекты должны быть найдены. Затем выберите нужное масштабирование сигнала из автоматического масштабирования или фиксированного масштаба.
Для сегментации объектов выберите основной компонент из раскрывающегося списка. Чтобы обнаружить объекты, соприкасающиеся с другими объектами, как отдельные, а не объединенные объекты, установите флажок Максимальный размер и пиксели, а затем выберите уточненное разделение. Затем подсчитайте все стромальные клетки в иммунных клетках отдельно, чтобы выразить данные в процентах иммунных клеток относительно общего количества стромальных клеток для каждого захваченного изображения.
Позже отобразите итоговое количество ячеек как среднее значение всех полей. С помощью редактора представлений изучите полученные таблицы данных после обработки, а затем экспортируйте таблицу данных счетчика. В репрезентативном анализе четыре типа иммунных клеток в образце эндометрия мы дифференцированы.
Обработанное изображение показывает сегментацию тканей как эпителиальных, так и стромальных компартментов. Мультиплексное иммуноокрашивание было выполнено на биопсии эндометрия у фертильной контрольной женщины и женщины с необъяснимым рецидивирующим выкидышем, один пол для нас, представляющий CD3, CD56, CD68 и CD20, были выявлены в иммуноокрашивании. Как только иммунный звук был идентифицирован, дальнейшее окрашивание под цитокином может помочь решить их взаимодействие и механизм успеха имплантации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании рассматриваются проблемы одновременной характеристики плотности и кластеризации основных иммунных клеток в эндометрии с использованием мультиплексного иммуногистохимического анализа и мультиспектральной визуализации. Приводится подробный протокол окрашивания для одновременной локализации четырех типов иммунных клеток в эндометрии.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Иммунология
- Биология эндометрия
- Методы мультиплексной визуализации
Теоретическая часть
- Значимость характеристики иммунных клеток в репродуктивной биологии.
- Проблемы традиционных методов окрашивания.
- Достижения в области технологий визуализации.
Используемые методы
- Мультиплексный иммуногистохимический анализ
- Образцы тканей, фиксированные в формалине и залитые парафином
- Мультиспектральная визуализация
Основные результаты
- Успешно дифференцированы четыре типа иммунных клеток (CD3, CD56, CD68, CD20) в эндометрии.
- Визуализировано распределение и кластеризация иммунных клеток.
- Предложены усовершенствования протокола для дальнейших исследований.
Выводы
- В исследовании продемонстрирован надежный метод анализа иммунных клеток в эндометрии.
- Это имеет важное значение для понимания репродуктивного здоровья и успеха имплантации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Мультиплексное флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание позволяет одновременно количественно определять несколько популяций иммунных клеток в одном срезе ткани, что восполняет критический пробел в исследованиях репродуктивной иммунологии. Данный подход способствует механистическому снижению рисков при проверке гипотез о микроокружении эндометрия, предоставляя данные пространственно-разрешенного мультиплексного иммунного профилирования непосредственно из образцов, полученных от пациентов. Этот метод повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней, связанных с неудачей имплантации и привычным невынашиванием беременности, за счет возможности прямого сравнения плотности и кластеризации иммунных клеток в фертильном и патологическом состояниях.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы, касающиеся взаимодействия иммунных клеток в эндометрии, посредством одновременного детектирования маркеров CD3, CD56, CD68 и CD20.
- Практическая ценность: снижает необходимость в серийном срезе и окрашивании, что позволяет сберечь ценные клинические образцы и увеличить плотность данных на один срез ткани.
- Прогностическая достоверность: обеспечивает количественные, пространственно-разрешенные показатели иммунных клеток, которые способствуют биологической проверке мишеней, участвующих в иммунном взаимодействии в эндометрии во время имплантации.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых флуоресцентных сигналов, подходящих для платформ высококонтентного имиджинга и автоматизированных рабочих процессов анализа изображений.
- Масштабируемость: Совместимость с биобанками тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE), что позволяет проводить ретроспективный анализ больших когорт для поиска биомаркеров.
- Оптимизация мультиплексирования: Устранение интерференции флуорофоров за счет циклов последовательного окрашивания и стриппинга, что обеспечивает специфичность сигнала для каждого маркера иммунных клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, имеющая значение для заболевания: может быть применена непосредственно к биоптатам эндометрия человека, представляя собой клинически значимую модель для изучения иммунной дисрегуляции при привычном выпадении плода.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между иммунным профилированием на этапе поиска и доклинической валидацией, позволяя проводить согласованное иммунофенотипирование различных типов образцов.
- Снижение механистических рисков: позволяет исследовать опосредованные цитокинами взаимодействия иммунных клеток после первоначальной идентификации типов клеток, что облегчает валидацию мишеней на уровне сигнальных путей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод относится к фазе поисковой биологии и, в частности, поддерживает работу по валидации иммунных мишеней и фенотипическому скринингу в рамках программ по репродуктивной иммунологии.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о составе и пространственной организации иммунных клеток в эндометрии в окно имплантации.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных данных иммунофлуоресценции, которые позволяют сравнивать плотность иммунных клеток и характер их кластеризации при различных экспериментальных условиях.
- Аналитика: предоставляет данные о мультиплексной интенсивности флуоресценции и ко-локализации, необходимые для фенотипирования иммунных клеток и определения их функционального состояния.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от анализа образцов человека к последующим исследованиям механизмов, предоставляя валидированные маркеры иммунных клеток для дальнейших функциональных анализов.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает повторно используемую платформу иммуноокрашивания, применимую для множества исследований иммунного профилирования эндометрия и других тканей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, обеспечивая прямое мультиплексное сравнение популяций иммунных клеток в тканях с патологией и в контрольных тканях.
- Операционная ценность: повышает эффективность использования реагентов и снижает вариабельность за счет оптимизированных протоколов последовательного окрашивания и снятия меток на одном предметном стекле.
- Стратегическая ценность: обосновывает решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в области репродуктивной терапии, проясняя вклад иммунного микроокружения в успех или неудачу имплантации.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе плотности иммунных клеток, их кластеризации и пространственной корреляции с эпителиальными или стромальными компартментами.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммуногистохимии, флуоресцентной микроскопии и мультиспектрального анализа изображений для точного обнаружения и количественного определения сигнала.
- Зависит от наличия систем демаскировки антигенов на основе микроволнового излучения, слайд-сканеров с возможностью флуоресцентного анализа и валидированных наборов флуорофоров Opal для мультиплексного циклирования.
- Необходима стандартизация условий блокировки, инкубации антител и стриппинга в разных лабораториях для обеспечения воспроизводимости результатов мультиплексного анализа.
- Требуется адаптация панелей антител и этапов валидации при применении метода к различным типам тканей или маркерам иммунных клеток, помимо CD3, CD56, CD68 и CD20.
- Практические ограничения включают возможный перехлест спектров флуорофоров и необходимость тщательного спектрального разделения при визуализации, что решается путем последовательного стриппинга и использования валидированных настроек фильтров.
