Модель кровотечения при трансекции хвостовой вены у полностью обезболенных мышей с гемофилией А

Модели хвостовых кровотечений могут быть важными инструментами для оценки фармакологических эффектов гемостатических соединений in vivo для обеспечения воспроизводимости между экспериментами. По сравнению с другими чувствительными моделями кровотечения, наша модель использует кровопотерю и время кровотечения в качестве конечных точек вместо выживания. Кроме того, модель выполняется под наркозом, тем самым уменьшая боль и дистресс для животных.

Эта методика особенно полезна для доклинического исследования гемофилии и других нарушений свертываемости крови, так как измеряет способность крови сворачиваться и останавливать кровотечение после травмы. Мы широко использовали эту модель, тестируя соединения прокоагулянтов в нашей работе для разработки новых методов лечения гемофилии с использованием мышей с гемофилией А. Тем не менее, другие гемофильные штаммы мышей или мыши, у которых гемофилия индуцируется антифакторным антителом VIII, также могут быть использованы.

Эксперимент продемонстрируют Сара и Деннис, которые являются экспертами-техниками в моей лаборатории. После обезболивания мыши поместите ее на нагревательную пластину и убедитесь, что нос находится в носовом конусе. Нанесите подходящую глазную мазь, чтобы предотвратить сухость под наркозом.

Отметьте хвост диаметром 2,5 миллиметра с помощью блока хвостовой метки, заботясь о том, чтобы хвост не загонялся в щель и следил за тем, чтобы он плотно прилегал. Затем поместите хвост в соляную трубку не менее чем на пять минут, чтобы обеспечить теплую хвостовую вену, оптимальную для внутривенного дозирования. При необходимости внутривенное дозирование может быть выполнено через пять минут.

Затем поместите пластиковую крышку поверх мыши, чтобы уменьшить потери тепла. Оставьте хвосты погруженными в течение пяти минут после дозирования тестового раствора, а затем выполните трансекцию хвостовой вены, поместив хвост в режущий блок и повернув его на 90 градусов, чтобы обнажить вену. Сделайте разрез на противоположной стороне от того места, где был дозирован исследуемый раствор.

Проведите лезвием скальпеля No 11 через щель режущего блока, удерживая хвост, чтобы создать кровотечение. Затем сразу же верните хвост в солевой раствор и сбросьте секундомер. Кровотечение должно быть видно сразу.

Погружение хвоста в физиологический раствор важно для постоянного кровотечения, так как оно быстро остановится в свободном воздухе. Наблюдайте за кровотечением и аннотируйте начало и остановку кровотечения в течение 40 минут на бумаге для записи кровотока. Дисквалифицировать и заменить мышь, если первичное кровотечение не прекращается в течение трех минут после реза, что может указывать на то, что порез слишком глубокий или что у мыши дефицит первичного гемостаза.

Бросьте вызов порезу хвоста, если нет кровотечения, через 10, 20 и 30 минут после травмы. С помощью марлевого тампона, смоченного и теплого солевого раствора, поднимите хвост из солончака и мягко, но твердо протрите его дважды влажной марлей в дистальном направлении над хвостовым срезом. Немедленно повторно погружайте хвост в соляную трубку после каждого вызова.

Когда эксперимент будет завершен, извлеките хвост из физиологического раствора, при желании соберите образцы крови и усыпите мышей, все еще находясь под полной анестезией. Центрифугируйте 15-миллилитровые пробирки для сбора крови физиологическим раствором в 4 000 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант из трубок.

Повторно суспендируют гранулу в двух миллилитрах раствора для лизирования эритроцитов. Затем разбавьте его до 12 дополнительными миллилитрами раствора лизинга, пока он не достигнет светлого кофейного цвета. Запишите общий объем и переведите два миллилитра разведения в гемоглобиновую трубку.

Охладить его до анализа гемоглобина. Значительное снижение кровопотери для групп лечения рекомбинантным фактором свертывания VIII наблюдалось с использованием оптимизированного протокола. Доза 20 международных единиц на килограмм полностью нормализовала кровотечение, а 10 МЕ на килограмм вызвали значительный эффект, уменьшив кровопотерю почти до верхней границы диапазона дикого типа.

Аналогичные результаты наблюдались и для времени кровотечения. Снижение наблюдалось в группах 5, 10 и 20 МЕ на килограмм, будучи полностью нормализованным в группе 20 МЕ на килограмм. У мышей дикого типа общая кровопотеря варьировалась от 200 до 840 наномолей гемоглобина, а у транспортных мышей — от 5 300 до 7 100 наномолей гемоглобина.

Среднее кровотечение составило 5 200 наномолей у мышей, обработанных транспортным средством, и 720 наномолей в группе 20 МЕ на килограмм. Время кровотечения у мышей дикого типа варьировалось от одной до девяти минут, а уровни дозы 10 и 20 МЕ на килограмм уменьшали время кровотечения до этого диапазона. Сильная корреляция между кровопотерей и временем кровотечения наблюдалась в комбинированных данных.

Все зарегистрированные эпизоды кровотечения были построены, чтобы обеспечить визуализацию длины и количества кровотечений, испытываемых для каждой отдельной мыши. Обратите внимание, что в группе транспортных средств после второго испытания большинство животных продолжают кровотечение до конца эксперимента. Измерение концентрации фактора VIII в плазме подтвердило, что эффект, наблюдаемый при снижении кровопотери и времени кровотечения, был рекомбинантным фактором VIII, зависящим от концентрации.

Количество тромбоцитов не было заметно затронуто, и уровни гематокрита были в пределах нормального диапазона у животных, получавших умеренные и более высокие дозы рекомбинантного фактора VIII, но значительно ниже у животных, которые интенсивно кровоточили, например, в транспортном средстве и одной МЕ на килограмм групп. У животных, испытывающих сильное кровотечение, может возникнуть незначительное влияние на показатели крови, особенно на общий гемоглобин или гематокрит. Чтобы оценить влияние пола в этой оптимизированной модели, результаты кровопотери и времени кровотечения были подвергнуты двустороннему анализу ANOVA с полом и дозой в качестве факторов.

Эти результаты показали, что реакция на лечение не различается между полами. Правильная маркировка хвоста и создание разреза являются важными шагами для обеспечения надежности и воспроизводимости в технике, как и проблема, если нет кровотечения. Кроме того, хорошая индукция анестезии и поддержание температуры тела животного особенно актуальны.

Мы также использовали эту модель для исследования остановки установленных кровотечений в более похожей на спрос обстановке путем лечения фактором VIIA через 10 минут после индуцирования кровотечения.