Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

Мы представляем экспериментальный протокол и рабочий процесс анализа данных для выполнения двухцветной флуоресцентной перекрестной корреляционной спектроскопии живых клеток (FCCS) в сочетании с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) для изучения динамики мембранных рецепторов в живых клетках с использованием современных методов флуоресцентной маркировки.

Флуоресцентная перекрестно-корреляционная спектроскопия является статистическим методом, который использует флуоресценцию результата времени для точного определения динамической сигнатуры рецепторов, связанных с G-белком, в живых клетках. Здесь нас особенно интересуют бета-2 адренергические рецепторы. Сфинголипидные рецепторы в основном предоставляют информацию о динамике трансляционной диффузии, а с помощью флуоресцентной анизотропии также и ротационную диффузию.

Вводя дополнительную метку, мы также можем способствовать связыванию или даже конформационным изменениям, если способствуем резонансной передаче энергии между метками, как зондируется. Количественная флуоресценция с временным разрешением требует тщательного выравнивания установок и калибровочных измерений. В следующие минуты мы предоставим экспериментальное руководство для корреляционной спектроскопии флуоресценции жизненных клеток, перекрестной корреляционной спектроскопии и резонансной передачи энергии Форстера рецепторов, связанных с G-белком, с использованием клоноспособных меток и синтетической силы потока.

Сидение и трансфиксирование клеток должны выполняться в стерильных условиях. Поместите чистую крышку штанги на тарелку для культивирования шести скважин и запивайте ее стерильным фосфатным буферным физиологическим раствором, добавьте два мл клеточной культуральной среды с феноловым красным, дополненным 10% фетальной бычьей сывороткой, 100 мкг, на амин пенициллин и 100 мкг на мл стрептомицина в каждую скважину, и держите его в стороне. Возьмите клетки CHO, которые культивируются в той же среде с фенол-красным при 37 градусах по Цельсию в пяти процентах CO2, и промыть их пятью мл PBS, чтобы удалить мертвые клетки.

Добавьте два мл трипсина и инкубировать в течение двух минут при комнатной температуре. Разбавить данные ячейки восемью мл среды фенолом красного цвета и тщательно перемешать путем пипетирования. Подсчитайте клетки в камере Нойбауэра и посадите клетки с плотностью 150 000 клеток на скважину в шестикомандной культурной пластине, содержащей крышку.

Дайте клеткам расти в инкубаторе в течение 24 часов, чтобы достичь примерно 80% слияния. Разбавьте два микрограмма нужной векторной ДНК. Например, CT SNAP или NT SNAP, и шесть микролитров этого трансфекционного реагента в две отдельные трубки.

Каждая содержащая 500 микролитров восстановленной сывороточной среды для каждой лунки и инкубировать их в течение пяти минут при комнатной температуре. Смешайте два раствора вместе для получения трансфекционной смеси и инкубировать ее в течение следующих 20 минут при комнатной температуре. Тем временем промыть сидячие клетки CHO один раз стерильным PBS.

Замените PBS одним мл на колодец фенольного красного свободного вещества, дополненного 10% фетальной бытовой сывороткой и без антибиотиков. Добавьте всю строительную смесь по одному мл капли в каждую скважину и инкубируют клетки в течение ночи при 37 градусах в пяти процентах CO2. Для маркировки разбавляют соответствующий субстрат SNAP в одной мл среде, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой для получения конечной концентрации одного микромоляра.

Промыть трансфекированные клетки один раз PBS и добавить один мл на щепку одного раствора микромолярной субстрата SNAP. Инкубировать клетки в течение 20 минут при 37 градусах в пяти процентах CO2. Трижды промыть клетки фенолом красной свободной средой, и добавить по два мл на хорошо фенольную красную свободную среду.

Инкубировать клетки в течение 30 минут при 37 градусах цельсия в пяти процентах CO2. Затем перенесите крышку всех образцов в камеру визуализации и промыть буфером визуализации 500 микролитров. Добавьте 500-микролитровый буфер изображения перед переходом к настройке FRED FCS.

Установка FRED FCS оснащена конфокальным микроскопом воды, двумя лазерными линиями, одной внешней системой подсчета времени, двумя гибридными BМТ и двумя акциями для сбора фотонов и программным обеспечением для сбора данных. Очень важно выравнивать установку каждый раз перед измерением в живых клетках. Для регулировки фокусировки, точечного отверстия и положения окраски поместите два наномолярных зеленых калибровочных раствора на стеклянную крышку и включите 485-нанометровый и 560-нанометровый лазер, работающий в сваях, чередующееся возбуждение или режим PI.

Сосредоточьтесь на растворе и отрегулируйте положение точечного отверстия и воротникового кольца таким образом, чтобы получить наибольшую скорость подсчета и наименьший конфокальный объем для получения максимальной молекулярной яркости. Повторите этот процесс для красных каналов с 10 наномолярными красным калибровочным раствором и смесью обоих. Поместите 10 раствора наномолярной ДНК на стеклянную крышку и отрегулируйте фокус точечного отверстия и положение воротникового кольца таким образом, чтобы цвета креста между зеленым и красным каналами обнаружения были самыми высокими.

То есть источник с самой высокой амплитудой. Для измерений в живых клетках найдите подходящую ячейку, ограничиваясь маркерной лампой и наблюдая через глаз. Включите оба лазера в режиме PI и сосредоточьтесь на мембране, ища максимальное количество в секунду.

Обратите внимание, что мощность лазера может потребоваться уменьшить для образцов клеток. Предпочтительно менее пяти микроватт на объекте. Это сильно зависит от используемого цвето- и установки.

Наблюдайте за автоматическими и перекрестными кривыми бета-2 AR, привязанного к EGP, и защелкивайте датчики тегов в онлайн-предварительном просмотре программного обеспечения для сбора данных и соберите несколько измерений сортировки со временем сбора от 60 до 180 секунд. Экспортируйте курс корреляции и контраст из всех измерений. Пожалуйста, позаботьтесь о том, чтобы здесь правильно определить окна времени подсказки и задержки и использовать опцию получения микро времени в программном обеспечении корреляции данных.

В общей сложности требуется три различных корреляции. Автоматическая корреляция зеленого окна подсказки канала. Автоматическая корреляция красных каналов и временного окна задержки.

И, наконец, перекрестная корреляция сигнала зеленого канала и окна времени подсказки была сигналом красного канала в окне времени задержки. Вот функции автоматической корреляции зеленого и красного FRED для решений и подгонка их к модели диффузии 3 DT с дополнительным триплетным термином, необходимым для калибровки формы и размера конфокального объема обнаружения для двух используемых цветовых каналов, где B - базовая линия кривой и количество молекул и фокус, TD — время диффузии и S, ноль над омега-нулем — форм-фактор конфокального объемного элемента. Триплетное мигание и физика фото описывается как амплитуда AR и время релаксации TR. Используйте известный коэффициент диффузии для зеленых и красных калибровочных различий и получайте форм-факторы для определения размеров и объема инфекционного конфокального объемного элемента.

Рассчитайте спектр поперек, как IFR, зеленый флуоресцентный сигнал, собранный на каналах нулей, и два в правильный канал обнаружения, канал первый и третий, как отношение фоновых собранных сигналов. Определите прямое ожидание акцепторного потока данных длинами волн возбуждения донора по соотношению фонового собранного контраста красных калибровочных измерений и быстрого возбуждения временного окна зеленым лазером к фону правильного учета прямо в окне задержки замедления возбуждения красным лазером. Рассчитать молекулярную яркость B как зеленой, так и красной силы потока исходя из фона собранного контраста, а также получить количество молекул и сосредоточиться на 3 DT диффузионного соответствия.

Соответствие как ультракорреляций из зеленого и красного канала, так и поперечной корреляции от зеленой подсказки и красной задержки двухуровневой ДНК к модели диффузии 3 DT сохраняет полученные формные коэффициенты постоянными для функций автоматической корреляции. Форм-фактор для функций перекрестной корреляции обычно находится между этими двумя значениями. Определите амплитуду при нулевом времени корреляции на основе значений шрифта видимого числа молекул и фокуса.

Расчет амплитудного соотношения для образца представлял собой 100%-ную кодиффузию силы зеленого и красного пола. Подгонка образцов клеток к соответствующей модели. То, как им показывали диффузию мембранных рецепторов, не любопытно в бимодальном режиме, было коротким, не длинным временем диффузии.

Кроме того, необходимо учитывать физику фотографий и силу мигания пола. Здесь к TD1 и TD2, являются двумя, требуемыми для времени диффузии. В отличие от калибровочного измерения, при котором свободные кости и нити ДНК диффузии, все направления мембранных рецепторов показывают только 2D-диффузию вдоль клеточных мембран, вычисляют концентрацию зеленых или красных меток белков из уважения количества молекул и фокуса.

И объем конфокального объемного элемента, используя смещение массы. Подогнать две альтовые корреляции двойной меченой выборки с использованием той же модели, что и для одноуровневой конструкции, и функцию перекрестной корреляции с использованием бимодальной диффузионной модели, Примечание для глобального описания системы. Все три культуры должны быть пригодны вместе.

Термин диффузии идентичен для всех трех культур. И разница лишь в том, что время репутации падает, функция перекрестной корреляции. Рассчитайте концентрацию зеленых или красных белков труда из соответствующего количества молекул и фокуса и объема конфокального объемного элемента.

Оценить фракцию или концентрацию взаимодействующих белков зеленой и красной меток из образцов клеток, используя поправочные коэффициенты, полученные из образцов ДНК, амплитудные соотношения образца клетки и соответствующие полученные концентрации. Подогнать две измененные корреляции образца FRED как единую меченую выборку и переднюю перекрестную корреляцию к бимодальной диффузионной модели, содержащей антикоррелярный термин, где AF отражает амплитуду общей антикоррелионной корреляции, а AR и TR - соответствующую амплитуду и время релаксации. В случае антикоррелированных флуоресцентных изменений из-за FRED может потребоваться один или несколько антикорреляторных терминов, что привело к падению функции перекрестной корреляции Фреда при низких корреляционных временах, совпадающих с повышением двух автокорреляционных функций.

Калибровка измерений зеленых и красных цветочных растворов с коэффициентами бритья 6,5 и зелеными каналами и 6,8 в красных каналах. Таким образом, конфокальный объем имеет размер 1,4 и 1,9 фемто, позже в этот день измерения яркость молекулы составляет 12,5 килогерц на молекулу и 2,6 килогерца на молекулу. У нас есть 15% перекрестных помех из зеленого цветочного в красные каналы после возбуждения донора и 38% прямых, кроме возбуждения красной цветочной формы зеленым, из нашего измерения ДНК мы определяем поправочные коэффициенты для конфокального перекрытия объема до 0,6 и 0,7 тоже, клетки, трансфектированные конструкцией с одной меткой, показывают бимодальную двухмерную диффузию на клеточной мембране, где примерно половина молекул медленно диффундирует на шкала времени от 50 до ста миллисекунд, а другая половина относительно быстрая около двух миллисекунд в обеих конструкциях.

Кроме того, присутствует триплет-мигание. Тем не менее, в конструкции красного уровня snap другое время релаксации приобретается в 180 микросекунд, что может быть связано с несвязанным щелчком прямо. Из самой двойной метки, транссектированной с помощью антищелковой конструкции, где две метки на двух разных сторонах клеточной мембраны, было собрано на два меньших измерения шума и красного слоя на корреляцию.

И перекрестная корреляция PI здесь довольно высока. Здесь 70% молекул, если вы медленно под сто миллисекундной шкалой времени, и только 30% быстро около одной миллисекунды, доля двойных освобожденных молекул низкая и лежит от 15 до 25% Данные для КТ выглядят лучше и менее шумные. Тем не менее, ожидаемая фронтовая самая глубокая антикоррелевация не может быть замечена и, скорее всего, массируется из-за большого количества перекрестных помех, прямого возбуждения принятия и триплетного мигания обеих цветочных сил, и после того, как схемы анализа данных, используя собранные схемы интенсивности флуоресценции DKS, могут помочь спасти это, как показано для моделируемого набора данных.

Преимущество техники Fred FCS заключается в том, что наряду с мобильностью мы можем исследовать динамику конференции GPCR. Тем не менее, выполнение FREDFC в лабораториях является сложной задачей и требует хороших трансфектированных клеток, эффективной маркировки и идеальной калиброванной настройки. Просто профессиональная сила пары FRED также очень важна.

Критические экспериментальные этапы включают оптимизацию трансфекции, минимизацию фона и автофлуоресценцию. Дополнительно и атомный конвейер анализа поможет понять различную динамику наставников в живых клетках. Мы надеемся, что этот протокол будет полезен для выполнения подхода FRED FCS в экспериментах с живыми клетками.