Обратный генетический подход к выявлению регуляторов пигментации с использованием рыбок данио-рерио
March 1st, 2022
Регуляторы функций меланоцитов регулируют видимые различия в результатах пигментации. Расшифровка молекулярной функции гена-кандидата в пигментацию представляет собой сложную задачу. Здесь мы демонстрируем использование модельной системы рыбок данио-рерио для идентификации кандидатов и классификации их по регуляторам содержания меланина и количества меланоцитов.
Этот протокол представляет собой объединение различных методов, которые позволят исследователям определить роль гена-кандидата в биологии меланоцитов. Это целостный подход к достижению логического вывода. Комбинируя различные методы, можно избежать смешанных факторов, и это может помочь исследователям получить существенный результат.
Чтобы начать анализ, иммобилизуйте 48 эмбрионов HPF 0,016% трикаина. Смонтируйте эмбрионы, используя несколько миллилитров от 1,5 до 2% метилцеллюлозы в чашке Петри. Соберите эмбрионы с помощью пипетки Пастера и поместите их в метилцеллюлозу, чтобы ограничить движение во время визуализации.
Для оптимальной боковой или дорсальной визуализации отрегулируйте их положение с увеличением более чем в 5 раз. Поместите чашку Петри под микроскоп. С помощью манипулятора отрегулируйте рыбок так, чтобы все пять эмбриональных полосок меланоцитов были видны одновременно.
Используя программное обеспечение для сбора данных, сделайте снимки. Если рыба проснется, поместите ее в трикаиновую воду, пока она не стабилизируется. Используя инструмент «Открыть» в программном обеспечении ImageJ, откройте изображение для количественной оценки.
Выберите инструмент «Фигура от руки», чтобы обвести область для анализа. Выберите параметр «Установить измерения», нажмите на среднее значение серого, а затем на область. Чтобы рассчитать среднее значение серого для выбранной области, нажмите на M или перейдите к анализу и выберите измерение.
В зависимости от интересующей стадии перенесите эмбрионы в чашку Петри, содержащую 0,6 миллиграмма на миллилитр проназы. Используя пипетку Пастера, перенесите дехорионированные эмбрионы в чашку Петри, содержащую простую воду для эмбрионов, через пять-10 минут. С помощью стеклянной пипетки Пастера соберите и перенесите около 100 эмбрионов в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.
Откажитесь от среды и добавьте 200 микролитров ледяного раствора Рингера для дежелтка. Поместите тюбик на лед и перемешайте содержимое около 20 раз пипеткой, чтобы растворить ярмо. Центрифугируйте пробирки при 100 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия дважды и выбросьте надосадочную жидкость.
Перенесите дейожелтированные эмбрионы с помощью пипетки объемом один миллилитр в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров раствора трипсина. Смешайте раствор один или два раза с помощью пипетки объемом один миллилитр, чтобы уменьшить агрегацию. Пропустите трипсинизированную суспензию через 70-микрометровое ситечко, помещенное на коническую трубку объемом 50 миллилитров, чтобы собрать одноклеточную суспензию.
Вымойте чашки Петри трипсинизированной суспензией, чтобы удалить прилипшие клетки с поверхности. Для подсчета флуоресцентно меченных клеток с помощью проточного цитометра после создания новой папки эксперимента нарисуйте прямую и боковую диаграмму рассеяния. Составьте гистограмму интенсивности флуоресцеина изотиоцианата.
Сначала загрузите ячейки дикого типа, чтобы установить прямые и боковые ворота рассеяния и порог FITC. После этого загрузите клетки, выделенные из трансгенных эмбрионов линии FTYRP GFP, для подсчета меланоцитов. Поместите эмбрионы в 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри.
Поместите его под микроскоп и отрегулируйте в желаемой ориентации с помощью наконечника пипетки. Используя программное обеспечение для сбора данных, приобретите изображения. Для эмбрионов менее 24 HPF, используя 10-кратное увеличение, захватите все изображение, в то время как для эмбрионов более 24 HPF получите несколько полей сканирования и впоследствии соберите их.
После проведения анализа визуализация Brightfield через 48 часов выявила наличие всех пяти пигментированных полос меланофора. На этапе 48 HPF было рассчитано количество латеральных меланофоров и обнаружено, что морфанты гистонного варианта h2afv продемонстрировали меньшее количество меланофоров по сравнению с контролем. Среднее значение серого было измерено для морфантов CA14 и h2afv, что показало, что значения были выше для вариантов, чем для контрольных морфантов.
Используя спектрофотометрический метод поглощения на основе гидроксида натрия, содержание меланина было количественно определено, когда морфанты CA14 показали меньшее содержание, чем контрольные морфанты. Флуоресцентная визуализация была выполнена для оценки морфолиновых изменений на разных стадиях развития меланофора рыбок данио. Количество меланофоров в морфантах CA14 и h2afv анализировали с помощью FACS.
Было отмечено, что количество меланофоров в СА14 оставалось неизменным, в то время как они были достоверно снижены в h2afv по сравнению с контрольным морфантом. Также была рассчитана средняя интенсивность флуоресценции на площадь, демонстрирующая, что морфанты h2afv демонстрируют значительное снижение значения по сравнению с контрольными морфантами. Регулируя рыбу перед визуализацией, убедитесь, что вы можете визуализировать все пять полос меланофора.
Нужно немного наклонить рыбу, чтобы различить две боковые полосы. Установив роль гена-кандидата в развитии меланоцитов, мы можем устранить ген тканеспецифическим способом с помощью технологии CRISPR. Это будет более целенаправленный подход.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование изучает роль кандидатных генов пигментации в биологии меланоцитов с использованием модельной системы на рыбе-зебре. Применяя различные методы визуализации и анализов, исследование выявляет ключевые регуляторы содержания меланина и числа меланоцитов.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Развитие меланоцитов
- Генетика пигментации
- Рыба-зебра как модельный организм
Бэкграунд
- Понимание молекулярной функции генов пигментации важно для расшифровки вариаций цвета кожи.
- Смущающие факторы в исследованиях могут помешать точной оценке функций генов.
- Эмбрионы рыбы-зебры обеспечивают эффективную модель для изучения ранних процессов развития пигментации.
Использованные методы
- Иммобилизация эмбрионов и методы визуализации
- Рыба-зебра как биологическая модель
- Флюороцитометрия для подсчета меланоцитов и спектрофотометрические анализы для определения содержания меланина
Основные результаты
- Снижение количества меланофор наблюдалось в морфантах h2afv по сравнению с контролем.
- Морфанты CA14 продемонстрировали меньшее содержание меланина по сравнению с контрольными морфантами.
- Флюоресцентная визуализация подтвердила различия в развитии меланофор.
Выводы
- Результаты исследования иллюстрируют важность определенных генов пигментации в развитии меланоцитов.
- Это исследование имеет более широкие последствия для понимания генетического влияния на пигментацию.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
