Иммунофлуоресценция, очистка и многофотонная микроскопия цельных яичников для количественного 3D-анализа развивающегося овариального резерва у мышей

Этот метод может помочь ответить на один из ключевых вопросов в репродуктивной области, а именно, как и когда генетически регулируемые процессы влияют на размер овариального резерва, который, как мы знаем, влияет на женщин, репродуктивное долголетие Этот протокол может быть принят для крупномасштабных исследований с использованием одних и тех же методов для интактных яичников с разных стадий развития. Он генерирует производимые данные, обеспечивая эффективную количественную оценку половых клеток. Этот метод, применяемый к генетически разнообразным животным одного и того же вида, может дать представление о генетических факторах непосредственно развития половых клеток и яичников и других органов развития.

Продемонстрировать процедуру будет Натаниэль Боэчат, стажер-исследователь из моей лаборатории Начать с обильного шага и закрепить анестезированную пубертатную самку мыши на спине, осторожно прижав все ноги через подушечки лап в расслабленном положении на доску. Чтобы открыть грудную полость мыши, аккуратно срежьте ребра по обеим сторонам грудины чуть ниже лопатки, избегая прокола легких, захватите кожу или реберные лоскуты щипцами и приколите лоскуты, чтобы обнажить внутренние органы, используйте рассеченные ножницы, чтобы перерезать правое предсердие сердца и выпустить кровь из системы. Затем, удерживая сердце щипцами, вводят перфузионную иглу в левый желудочек и перекачивают 10 миллилитров PBS с мягким и постоянным давлением.

Когда ткани, такие как почки печени и репродуктивный тракт, превратились из розового в белый, заменяют PBS свежевыделенным 1% параформальдегидом или PFA и продолжают перфузию примерно 10 миллилитрами PFA. Затем найдите жировую подушку с яичниками ниже почки и аккуратно рассекните весь репродуктивный тракт, включая жировую подушку яичников и маточных рогов, чтобы поместить ее во флакон с 4% PFA. Зафиксируйте яичники при комнатной температуре в течение 16-24 часов, прежде чем заменить 4% PFA на 70% этанол.

В день окрашивания обрежьте яичники, прежде чем приступить к иммуно окрашиванию. В первый день протокола иммуноокрасления пипетка один миллилитр ПБС на скважину в нужное количество лунок в чистой 24 скважинной пластине. Отрежьте наконечник 1000-микролитрового наконечника пипетки, чтобы сделать широкое отверстие, и используйте широкий наконечник, чтобы аккуратно перенести пубертатные яичники из флаконов с 70% этанолом в колодцы, затем замените PBS в скважине свежим 0,8 миллилитра PBS На следующий день аспират PBS из скважин заменит его 0,8 миллилитрами буфера проникновения на скважину.

После инкубации пластин на шейкере при комнатной температуре в течение четырех часов замените буфер проникновения блокирующим буфером На третий день подготовьте первичные антитела путем разведения в блокирующий буфер. Для визуализации ооцитов инкубируют пренатальные и препубертатные яичники с маркерами ооцитов. На восьмой день промывайте образцы свежим промывочным буфером в течение двух часов, затем замените буфер промывки 0,5 миллилитрами вторичных смесей антител, разбавленных в блокирующем буфере.

Запечатайте пластину парапленкой для предотвращения испарения и инкубируйте образцы при комнатной температуре в темноте в течение трех дней. На 11 день после иммуноокрасления промыть аспирировать промывочный буфер и инкубировать образцы с 0,8 миллилитрами шкалы кубического одного раствора при 37 градусах Цельсия в течение трех дней в темноте. Смена шкалы кубического одного раствора ежедневно.

На 15 день промыть образцы трижды в течение 10 минут и 0,8 миллилитра PBS при комнатной температуре с легким встряхиванием. Затем замените PBS 0,8 миллилитрами свежеприготовленной дегазированной 20%-сахарозы PBS с последующим мягким встряхиванием при комнатной температуре. Через час заменяют 20%-ный раствор сахарозы для обработки образцов 0,8 миллилитрами шкалы кубических двух растворов в течение четырех-пяти дней, как объяснялось ранее.

Чтобы подготовить образец, используйте 200-микролитровый наконечник пипетки с отсечкой наконечника, чтобы перенести пубертатные яичники с 15-20 микролитрами чешуйки кубических двух растворов в середину клеевого колодца. После того, как яичники перенесены в отдельный колодец с каплей очищающего раствора, аккуратно поместите покровное стекло на клеевой колодец и нажмите, чтобы создать уплотнение, сэндвичинг образцов и очищающий раствор между двумя крышками. Для размещения изображений крышка проскальзывает сэндвич в 3D-печатном слайде адаптера микроскопа.

Настройте параметры для получения изображения в соответствии с микроскопическими сердечниками или спецификациями производителя. При наличии используйте двунаправленное получение изображения, чтобы сократить время сканирования и повысить эффективность. Отрегулируйте среднее линейное, среднее значение кадра и накопление кадров в программном обеспечении.

Настройте стек Z, определив начальное и конечное положение, затем выберите размер шага Z в два микрометра для препубертатных яичников и пять микрометров для пубертатных яичников. Затем активируйте функцию компенсации Z и усиление возбуждения. Установите Z-компенсацию для нижней и верхней части образца, выбрав интенсивность лазера для обоих.

Используйте режим разбиения мозаики для больших образцов, которые не могут быть захвачены в одном поле зрения. Активируйте навигатор изображений и укажите количество плиток, необходимых для захвата всего образца с помощью инструмента прямоугольной маркировки. После завершения настройки начните с получения изображения для изображений с несколькими плитками, начните получение изображения с помощью навигатора, чтобы захватить все плитки.

После получения изображения сохраните все изображения. А если было получено несколько плиток, запустите инструмент объединения мозаики, чтобы объединить плитки в одно изображение. Чтобы определить размер ооцитов, откройте изображение и выберите параметр фрагмента, чтобы открыть изображение стека Zs.

Выберите параметр линии и панель измерения и измерьте расстояние, проведя линию от одного края ооцитов или маркера до другого края в самой широкой точке, чтобы определить диаметр X Y яйцеклетки. Пройдитесь по стеку и получите диапазон диаметров для нескольких ооцитов одного типа. Используйте самую короткую длину в качестве критерия выбора размера для подсчета ооцитов.

Затем в параметре «3D-вид» выберите функцию «Пятна». На панели сцены активируйте функцию добавления новых пятен, чтобы открыть панель алгоритмов. Затем отмените выбор всех настроек алгоритма в качестве фильтра выбора размера с размером ооцитов, полученным ранее.

Щелкните стрелку канала вперед, чтобы перейти к исходному каналу. Затем выберите канал с предпочтительным маркером и введите полученный диаметр в расчетный диаметр X, Y. После выбора размера активируйте удлинение модели PSF и вычитание фона, которые определяются автоматически.

Затем щелкните одну стрелку вперед, чтобы перейти на панель фильтрующих пятен, и добавьте фильтр качества, чтобы определить пороговое значение. Для обеспечения точной оценки численности ооцитов увеличьте изображение. Позже нажмите на двойную стрелку, чтобы завершить автоматический подсчет.

Используйте вкладку редактирования, чтобы вручную выбрать пропущенные ооциты или отменить выбор частиц ноноцитов, выбранных автоматическим порогом. Когда это будет сделано, запишите данные на вкладке статистики под общей вкладкой для дальнейшего анализа. Чтобы оценить общее количество ооцитов и поврежденные яичники, откройте изображения интактных яичников с помощью МРС и выберите признак кадра.

Под параметрами фрейма установите флажки сетки и метки доступа. На вкладке XYZ выберите 200 микром, чтобы генерировать метки с 200 микрометровыми пробелами во всех позициях XYZ. Используя 200-микрометровые метки, выберите ооциты, которые попадают в пределах 50% объема каждого яичника.

Нажмите на функцию пятен и выберите метки редактирования, чтобы классифицировать ооциты, которые попадают в область 50% по цвету. В репрезентативных оттенках серого видны многофотонные изображения неперфузированных и перфузированных яичников, мелких ооцитов в первичных фолликулах с тонким слоем цитоплазматического окрашивания DDX4. Кроме того, были обнаружены более крупные ооциты в растущих фолликулах.

Изучены 3D-рендеры из многофотонных изображений пренатальных и постнатальных яичников. На 28-й послеродовой день яичник от контрольной необлученной самки содержал большую популяцию мелких ооцитов в примордиальных фолликулах. Напротив, яичники у облученной самки с 0,5 серого гамма-излучения были полностью лишены мелких ооцитов в первичных фолликулах.

Но более крупные ооциты все еще присутствовали. Для количественной оценки ооцитов 3D-многофотонные изображения были обработаны в программном обеспечении MRS с использованием фильтра Гусиана, а ооциты малых и больших размеров были идентифицированы и количественно определены с использованием точечного признака. Далее средний процент ооцитов был рассчитан на каждой стадии по сравнению со средним числом присутствующих на самой ранней стадии Е 15,5 количество ооцитов резко снизилось между Е 15,5 и Е 18,5, Е 15,5 и Е 18,5 фетальные ооциты экспрессировали линию один орф один Р, как видно на многофотонных изображениях.

Анализ интенсивности показал более высокую экспрессию линии один или один Р на ооциты при E 18,5, чем E 15,5. Яичники с небольшими повреждениями могут быть использованы для анализа. Общее количество ооцитов определяется с помощью вычислительной коррекции.

Репрезентативная модель показывает положительные ооциты G CNA в яичнике E 15,5 с пятью 10% областями, выделенными в интактном яичнике. Аналогичным образом, был сгенерирован смоделированный яичник с 10% добавочными областями, отсутствующими до 50% яичника. Общее количество ооцитов и смоделированные яичники сравнивались с исходными интактными яичниками.

И разница была представлена как процентное отклонение Хорошая перфузия приводит к хорошему качеству изображения. Поэтому убедитесь, что все ткани очищены с помощью PBS, прежде чем переходить на PFA. Убедитесь, что яичники полностью обнажены, обрезав лишнюю ткань.

Протокол позволяет эффективно анализировать большое количество образцов, количественные данные, полученные из генетических эталонных популяций, таких как совместный перекрестный или разнообразный вывод, помогут идентифицировать генетические модификаторы развития ооцитов и количества ооцитов.