Сбор, расширение и дифференциация первичных моделей эпителиальных клеток носа человека для количественной оценки частоты биения ресничек
10 ноября 2021 г.
Этот протокол описывает сбор, расширение и дифференцировку эпителиальных клеток носа в органотипические модели эпителиальных клеток дыхательных путей и количественную оценку частоты биения ресничек с помощью визуализации живых клеток и специально разработанных сценариев.
Мы описываем сбор стволовых клеток дыхательных путей из слизистой оболочки носа. Эти клетки расширяются и дифференцируются в псевдостратифицированный эпителий в лаборатории. Это расширение и дифференцировка in vitro, которая похожа на наши дыхательные пути in vivo, что означает, что существуют специализированные клетки, такие как реснитчатые клетки, которые можно использовать для количественной оценки частоты биения ресничек.
Чтобы обеспечить последовательную и воспроизводимую количественную оценку частоты биения ресничек между различными людьми и в ответ на различные препараты, мы стандартизируем условия культивирования и получение изображений. Измерения частоты биения ресничек используются в качестве клинических инструментов при таких заболеваниях, как первичная цилиарная дискинезия. Мы надеемся установить это как клинический маркер муковисцидоза.
Эту процедуру демонстрируют Кейтлин Аллан и Лора Фосетт, аспиранты из моей лаборатории, и доктор Шэрон Вонг, постдок из моей лаборатории. Начните с того, что попросите участника дышать ртом. Затем, взяв цитологическую кисть в доминирующей руке и положив пятую цифру на подбородок участника, чтобы закрепить руку, вставьте цитологическую кисть в носовой проход участника под углом 45 градусов к лицу участника и проведите ее через носовой мяс.
После поворота щетки в вертикальном положении, чтобы она была перпендикулярна лицу участника, осторожно, но твердо, подвиньте кисть к боковой стенке носа под нижней носовой раковиной, пока она не окажется в средней и задней части нижней носовой части. Поверните кисть на 360 градусов до трех раз. Затем аккуратно удалите его, обратив вспять маневр вставки, чтобы клетки не смещались с кисти.
Поместите кисть в подготовленную коллекционную трубку со средой для сбора носовых клеток и поместите сборную трубку на лед. После мягкого вихря, чтобы выбить клетки из щетки, перенесите сборную трубку на льду обратно в шкаф биобезопасности. Используя серологическую пипетку, перенесите среду из коллекционной трубки в новую трубку, оставив после себя цитологические щетки.
Затем центрифугируйте образец. После центрифугирования повторно суспендируют клеточную гранулу в одном миллилитре условного перепрограммирования клеточной среды. Затем, используя пятимиллилитровую серологическую пипетку, пропустите клетки через клеточное сито, помещенное поверх 50-миллилитровой трубки круговыми движениями.
Чтобы получить одноклеточную суспензию, соберите суспензию со дна трубки и пропустите ее через сито несколько раз. Затем выбросьте клеточное сито. Чтобы засеять эпителиальные клетки дыхательных путей на подготовленные проницаемые опорные вставки, хорошо перемешайте клетки, не создавая пузырьков, гарантируя, что они однородны и находятся во взвешенном состоянии.
Затем добавляют 150 микролитров клеточной суспензии на апикальную сторону подготовленных проницаемых опорных вставок. Чтобы дифференцировать эпителиальные клетки дыхательных путей на границе раздела воздух-жидкость, культивируйте их в дифференцировке или среде ALI в течение двух дней. Затем аспирируйте среду и добавьте 750 микролитров среды ALI только в базальный отсек для создания воздушно-жидкостного интерфейса.
Чтобы засеять эпителиальные клетки дыхательных путей в куполах ECM, повторно суспендировать диссоциированные эпителиальные клетки дыхательных путей с соответствующим объемом 90% ECM. Затем, удерживая пипетку вертикально под углом 90 градусов как можно ближе к дну колодца, дозируйте 50 микролитров суспензии ячейки ECM к центру лунки. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут, пока ECM не затвердеет.
В то время как ECM затвердевает, нагрейте органоидную среду для посева дыхательных путей или AOSM до комнатной температуры, чтобы предотвратить ее повторное сжижение и распад купола ECM при добавлении. После инкубации добавьте 500 микролитров подогретого AOSM в каждый колодец, раздав его по стенке. Не наносите пипетку непосредственно на купол ECM.
Меняйте носитель каждые два дня в течение четырех-семи дней. Чтобы аспирировать среду, наклоните пластину под углом 45 градусов и аспирируйте от нижнего края колодца подальше от купола ECM. Через четыре-семь дней инициируйте дифференцировку органоидов, добавляя 500 микролитров подогретой органоидной дифференцировки дыхательных путей, или AODM, в каждую лунку, и меняйте среду каждые два дня в течение семи дней.
Поместите культуральную пластину, содержащую модели эпителиальных клеток дыхательных путей, во вставку пластины микроскопа и закройте камеру окружающей среды микроскопа. Дайте образцу уравновеситься в предварительно нагретой, 37 градусов по Цельсию, 5% заполненной углекислым газом камере микроскопа в течение 30 минут. В окуляре микроскопа сосредоточьтесь на модели клетки.
Затем, используя программное обеспечение для сбора данных, нажмите L100, чтобы переключить световой путь к порту, где установлена камера. Нажмите зеленую кнопку «Воспроизвести», чтобы визуализировать поле зрения микроскопа с помощью программного обеспечения. Убедитесь, что реснички находятся в фокусе, и при необходимости отрегулируйте.
Чтобы получить покадровые изображения из меню, нажмите «Получить», а затем «Fast TimeLapse». Во всплывающем окне выберите место сохранения и имя файла, получите 1 000 кадров. Чтобы просмотреть реснички в поле зрения микроскопа, нажмите «Применить», а затем зеленую кнопку «Воспроизвести».
При необходимости отрегулируйте Z-фокус. Затем нажмите кнопку Выполнить сейчас, чтобы записать Fast TimeLapse. После установки необходимого программного обеспечения и наборов инструментов скопируйте соответствующие пользовательские сценарии анализа и папку сценариев поддержки на локальный диск компьютера.
Затем, после компьютерного программного обеспечения, нажмите на вкладку «Главная», а затем «Установить путь». Во всплывающем окне нажмите Добавить с вложенными папками. Под путем поиска MATLAB выберите отображаемую папку.
Затем нажмите «Сохранить и закрыть». Убедитесь, что сценарии анализа связаны с вычислительным программным обеспечением, проверив, что они отображаются на левой панели. Затем перенесите пример необработанных файлов образов, полученных на локальный диск компьютера.
Затем нажмите на BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m файл скрипта анализа в вычислительном программном обеспечении. Чтобы запустить скрипт, нажмите на вкладку Редактор, а затем зеленую кнопку Play.
В появившемся окне приглашения выберите необработанные файлы изображений для анализа. Введите время экспозиции для времени получения за кадр. Затем нажмите OK. Запустите объект GetFirstAmplitude.
m скрипт в папке, содержащей файлы AveSpectrum. Подождите, пока сценарий выведет FirstAmplitudeStacked. xlsx файл, который содержит наибольшую амплитудную частоту и находится в физиологическом диапазоне биения эпителиальных ресничек дыхательных путей.
Скопируйте значения частоты из firstAmplitudeStacked. xlsx, и построить их с помощью программного обеспечения для научного анализа. Представлены результаты частоты биения ресничек, измеренных в моделях ALI эпителиальных клеток дыхательных путей, полученных от трех участников с муковисцидозом и трех здоровых контрольных участников.
На 14-й день дифференциации культуры присутствовали биение ресничек. С 14-го, 21-го дня дифференциации культуры статистически значимого увеличения частоты биения ресничек между когортами не наблюдалось. На 21-й день дифференциации культуры средняя частота биения ресничек у здоровых контрольных участников была значительно выше, чем у участников с муковисцидозом.
Кроме того, когда частота биения ресничек была изображена в тех же клеточных моделях после удаления слизи, наблюдалось статистически значимое увеличение частоты биения ресничек при удалении слизи в моделях ALI как здоровых людей, так и людей с муковисцидозом. Среда визуализации должна строго регулироваться, так как функция ресничек чрезвычайно восприимчива к изменениям факторов окружающей среды. Эта платформа может быть создана для скрининга конкретных лекарств пациента, чтобы иметь возможность идентифицировать препараты, которые модулируют функцию CFTR.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описываются методы сбора и дифференцировки стволовых клеток дыхательных путей из слизистой оболочки носа в органотипические модели эпителиальных клеток дыхательных путей. В него включены методы количественной оценки частоты биения ресничек с использованием прижизненной визуализации клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Респираторная медицина
Теоретическая часть
- Стволовые клетки дыхательных путей можно получить из слизистой оболочки носа.
- Эти клетки можно экспансировать и дифференцировать in vitro.
- Полученные модели имитируют эпителий дыхательных путей in vivo.
- Реснитчатые клетки имеют решающее значение для изучения функции ресничек.
Цель исследования
- Стандартизировать условия культивирования эпителиальных клеток дыхательных путей.
- Обеспечить воспроизводимую количественную оценку частоты биения ресничек.
- Изучить частоту биения ресничек в качестве клинического маркера заболеваний.
Используемые методы
- Сбор стволовых клеток дыхательных путей из слизистой оболочки полости носа.
- Экспансия in vitro и дифференцировка в псевдостратифицированный эпителий.
- Визуализация живых клеток для оценки частоты биения ресничек.
- Специально разработанные скрипты для анализа данных.
Основные результаты
- Успешная дифференцировка эпителиальных клеток носа в функциональные модели.
- Разработка стандартизированных методов измерения частоты биения ресничек.
- Потенциал применения частоты биения ресничек в клинической диагностике.
- Понимание роли ресничек в развитии респираторных заболеваний.
Заключение
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения эпителиальных клеток дыхательных путей.
- Количественная оценка частоты биения ресничек может помочь в диагностике респираторных заболеваний.
- Дальнейшие исследования могут подтвердить возможность использования этого показателя в качестве клинического маркера.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное определение частоты биения ресничек в первичных моделях эпителия носа человека представляет собой физиологически релевантную систему для оценки эффективности модуляторов CFTR. Данный подход способствует валидации мишени, связывая активность каналов CFTR с функциональным выходом ресничек в модели, соответствующей патологии заболевания. Стандартизированное измерение в контролируемых условиях среды позволяет проводить воспроизводимую оценку индивидуального отклика пациента для снижения рисков на доклиническом этапе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Исследование взаимосвязи между модуляцией CFTR и цилиарной функцией как конечным фенотипическим показателем.
- Практическая ценность: Позволяет проверять гипотезы о CFTR-зависимых механизмах в первичных клетках человека.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные динамические показатели цилиарной активности для скрининга соединений.
- Практическая ценность: стандартизированные условия культивирования и визуализации обеспечивают воспроизводимость анализа для разных доноров и условий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует патофизиологию дыхательных путей человека, включая подавление цилиарной активности слизью, что актуально для муковисцидоза.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность лонгитюдной оценки восстановления работы ресничек после очистки от слизи, что позволяет уточнить механизмы процесса.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в исследовательскую биологию, обеспечивая функциональную конечную точку для скрининга модуляторов CFTR, результаты которого используются для идентификации ведущих соединений и доклинической валидации.
- Открывающая биология: Обеспечивает снижение рисков при изучении механизмов путем количественной оценки цилиарного ответа на соединения, нацеленные на CFTR.
- Скрининг: Обеспечивает масштабируемые количественные измерения CBF, подходящие для подтверждения хитов и профилирования зависимости «доза-эффект».
- Аналитика: Специальные скрипты извлекают данные о частоте из высокоскоростной визуализации, что позволяет проводить статистическое сравнение между группами лечения.
- Трансляционные исследования: Моделирование эпителия дыхательных путей человека с естественной выработкой слизи, что позволяет связать результаты in vitro с клиническим ответом на модуляторы CFTR.
- Корпоративное повторное использование: Платформа может быть применена в нескольких программах по изучению модуляторов CFTR для обеспечения согласованной и клинически значимой функциональной оценки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в эффектах модуляторов CFTR путем прямого измерения ресничной функции.
- Операционная ценность: контроль условий окружающей среды и стандартизированные протоколы снижают вариабельность и повышают воспроизводимость между лабораториями.
- Стратегическая ценность: позволяет прогнозировать ответ с учетом стратификации пациентов, что улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки модуляторов CFTR.
- Влияние на портфель: поддерживает движение проекта с учетом рисков за счет раннего выявления не отвечающих на терапию образцов на этапе доклинической оценки.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами клеток дыхательных путей, их дифференцировкой и соблюдение правил стерильности.
- Метод основан на использовании высокоскоростной видеомикроскопии и камер для визуализации с контролируемыми условиями окружающей среды.
- Необходима вычислительная инфраструктура для запуска специализированных скриптов анализа на базе MATLAB.
- При планировании исследований необходимо учитывать вариабельность базовой частоты биения ресничек в зависимости от донора.
- Стабильность условий окружающей среды (температура, CO2, влажность) имеет решающее значение для надежного измерения CBF.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Collection of Nasal Inferior Turbinate Brushings
2:25
Airway Epithelial Cell Expansion and Maintenance
3:23
Seeding and Differentiation of Airway Epithelial Cells and Maintenance of Differentiated ALI Models
4:12
Three-Dimensional Airway Epithelial Organoids
5:54
Imaging Cilia Beat Frequency
7:18
Data Analysis and Quantification of Cilia Beat Frequency
9:20
Results: Cilia Beat Frequency in Airway Epithelial Cell ALI Models of Cystic Fibrosis Patients and Healthy Participants
10:36
Conclusion
