Экономичный и эффективный протокол для выделения и культивирования дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мышей
1 июля 2022 г.
Здесь мы представляем экономичный и эффективный метод выделения и генерации дендритных клеток высокой чистоты костного мозга у мышей после 7 дней культивирования с 10 нг / мл GM-CSF / IL-4.
Экономичный и эффективный протокол выделения и генерации дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мыши. Процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по этике животных Института Нанкинского медицинского университета. С увеличением исследования опухолевого иммунитета спрос на клетки ПОСТОЯННОГО тока постепенно увеличивается.
Тем не менее, DC редко встречаются во всех тканях. Традиционный метод в основном индуцирования дифференцировки костного мозга в РС является сложным и дорогостоящим. Два. Выделение костного мозга и получение БМ-клеток Мы жертвуем мышами и фиксируем на мышином операционном столе.
Разрезают кожу левой обнаженной мышцы и бедренной артерии. Не перерезайте бедренную артерию напрямую. В противном случае это вызовет сильное кровотечение и загрязнит поле зрения.
Обрежьте все мышцы вокруг бедренной кости. Медленно растягивайте нижние конечности мыши наружу до выпадения головки бедренной кости и может наблюдаться. Отделите нижние конечности от тела.
Отрежьте заднюю ногу, чтобы получить свободную и полную бедренную кость. Удалите мышцы с помощью марли. Не разрывайте мышцы напрямую.
Бедренная кость мышей хрупкая. Поместите бедренную кость в 75% спирт на две-пять минут. Три. Инъекционную культуру BMDC промыть остаточным спиртом PBS.
Зажмите среднюю и нижнюю часть бедренной кости кровоостанавливающими щипцами, а нижний конец бедренной кости другим гемостатическими щипцами. Кровоостанавливающие щипцы наносятся буквально на бедренную кость, а бедренная кость отрывается от эпифизарной линии. Используйте один мл шприца для прокалывания полости костного мозга от эпифизарной линии.
Используйте полную среду двумя частями промывки полости костного мозга до тех пор, пока кость не станет белой. Собирайте промывочные жидкости. Дополняют полную среду, содержащую ГМ CSF/IL-4 до 24 мл, и высевают в 6-луночную пластину с 4 мл на лунку. Четыре.Результаты.
Через два дня замените все среды, содержащие GM-CSF/IL-4. Половина заменила полную среду, содержащую GM-CSF/IL-4, на четвертый, шестой и восьмой день. Количество клеток достигло пика на седьмой день, а затем постепенно уменьшалось.
Клетки DC образовали большое количество синапсов, демонстрирующих типичную зрелую морфологию клеток DC. Субметрические анализы потока показывают, что соотношение CD11c наложило то, что 71% на шестой день, широкое соотношение увеличилось до 96,1% на 10-й день. Экспрессия CD11c, CD80 и MSC2 постепенно увеличивалась с увеличением времени культивирования. Пять.Заключение.
Короче говоря, мы создали экономичный и эффективный протокол для выделения и генерации дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мышей, который занимает всего 10 минут для разделения клеток костного мозга. Большое количество ДК высокой чистоты было собрано после шести-семи дней культивирования с 10 нг на мл, GM-CSF и IL-4.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен экономичный и эффективный метод выделения и получения высокочистых дендритных клеток из костного мозга мышей. Протокол включает 7-дневное культивирование с использованием GM-CSF/IL-4.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Дендритные клетки (ДК) имеют решающее значение для исследований иммунитета опухоли.
- ДК редко встречаются в тканях, что затрудняет их выделение.
- Традиционные методы дифференцировки ДК сложны и дорогостоящи.
- Данное исследование направлено на упрощение процесса получения ДК из костного мозга.
Цель исследования
- Разработка экономически эффективного метода выделения дендритных клеток (ДК).
- Повышение эффективности генерации ДК из костного мозга мыши.
- Поддержка исследований в области опухолевого иммунитета путем получения ДК высокой степени чистоты.
Используемые методы
- Выделение костного мозга мышей.
- Культивирование клеток костного мозга с GM-CSF/IL-4.
- Оценка чистоты и жизнеспособности клеток.
- Одобрение Институциональным комитетом по этике работы с животными.
Основные результаты
- Успешное выделение высокочистых дендритных клеток (ДК), полученных из костного мозга.
- Продемонстрированная эффективность нового протокола.
- Потенциал для более широкого применения в исследованиях противоопухолевого иммунитета.
- Сокращение затрат времени и средств по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Разработанный метод является жизнеспособной альтернативой для получения дендритных клеток.
- Данный подход может способствовать дальнейшим исследованиям в области иммунологии.
- В будущих исследованиях могут быть изучены возможности применения метода в различных терапевтических контекстах.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол решает проблему дефицита дендритных клеток для исследований в области иммунологии и противоопухолевого иммунитета, предлагая экономичный и высокопродуктивный метод выделения дендритных клеток из костного мозга мышей. Он позволяет масштабировать получение фенотипически охарактеризованных DC при снижении расхода реагентов и сокращении времени активной работы, что способствует валидации мишеней на ранних этапах и проведению механистических исследований в рамках разработки методов иммунотерапии. Данный подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, обеспечивая воспроизводимую и релевантную заболеванию систему для оценки иммуномодуляции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать функции дендритных клеток в процессах презентации антигена и путях активации T-клеток.
- Практическая ценность: Снижает стоимость и сложность получения дендритных клеток за счет использования стандартизированной дифференцировки с применением GM-CSF/IL-4.
- Научная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени посредством фенотипической характеристики экспрессии CD11c, CD80 и MHC II с течением времени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать популяции дендритных клеток высокой степени очистки (80%–95% CD11c+), подходящие для стандартизированных иммунологических анализов.
- Практическая ценность: обеспечивает выход до 2.7 x 107 клеток с одной мыши, что позволяет использовать форматы высокопроизводительного скрининга.
- Научная ценность: обеспечивает создание стабильной биологической системы для оценки влияния соединений на созревание дендритных клеток и иммунную функцию.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Создание релевантной для заболевания системы моделирования ответов дендритных клеток в контексте противоопухолевого иммунитета.
- Практическая ценность: Обеспечение возможности доклинической оценки иммуномодулирующих агентов с определенным клеточным составом.
- Научная ценность: Облегчение механического снижения рисков путем установления связи между фенотипом дендритных клеток и функциональными результатами в системах совместного культивирования.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в непрерывный цикл разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, обеспечивая возобновляемый источник дендритных клеток для проведения иммунологических анализов.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о дендритноклеточных иммунных путях и взаимодействии с мишенью.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные клеточные данные для оценки иммуномодулирующей активности.
- Аналитика: позволяет измерять экспрессию CD11c, CD80 и MHC II с помощью проточной цитометрии в качестве показателей созревания.
- Трансляционные исследования: связывает генерацию дендритных клеток in vitro с доклиническими моделями иммунной активации и толерантности.
- Корпоративное использование: устанавливает стандартизированный масштабируемый протокол получения дендритных клеток для различных проектов в области иммунологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации мишени за счет использования фенотипически определенных дендритных клеток в качестве входных данных.
- Операционная ценность: Сокращает временные и финансовые затраты благодаря 10-минутному забору костного мозга и низким дозировкам цитокинов (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные модели дендритных клеток для скрининга иммунотерапии.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию иммуномодулирующих кандидатов с учетом рисков с использованием стандартизированных иммунных эффекторных клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт выделения костного мозга мышей и навыки асептического культивирования клеток.
- Необходим доступ к 6-луночным планшетам, гемолитическим пинцетам и методу проточной цитометрии для фенотипической валидации.
- Требуется стандартизация концентрации цитокинов и графика смены среды для всех пользователей.
- При переходе на другие линии мышей или генетические фоны необходимо учитывать особенности адаптации.
- Ограничено окном культивирования продолжительностью 7–10 дней и связанным с этим снижением жизнеспособности клеток после достижения пика.
