Экономичный и эффективный протокол для выделения и культивирования дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мышей
July 1st, 2022
Здесь мы представляем экономичный и эффективный метод выделения и генерации дендритных клеток высокой чистоты костного мозга у мышей после 7 дней культивирования с 10 нг / мл GM-CSF / IL-4.
Экономичный и эффективный протокол выделения и генерации дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мыши. Процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по этике животных Института Нанкинского медицинского университета. С увеличением исследования опухолевого иммунитета спрос на клетки ПОСТОЯННОГО тока постепенно увеличивается.
Тем не менее, DC редко встречаются во всех тканях. Традиционный метод в основном индуцирования дифференцировки костного мозга в РС является сложным и дорогостоящим. Два. Выделение костного мозга и получение БМ-клеток Мы жертвуем мышами и фиксируем на мышином операционном столе.
Разрезают кожу левой обнаженной мышцы и бедренной артерии. Не перерезайте бедренную артерию напрямую. В противном случае это вызовет сильное кровотечение и загрязнит поле зрения.
Обрежьте все мышцы вокруг бедренной кости. Медленно растягивайте нижние конечности мыши наружу до выпадения головки бедренной кости и может наблюдаться. Отделите нижние конечности от тела.
Отрежьте заднюю ногу, чтобы получить свободную и полную бедренную кость. Удалите мышцы с помощью марли. Не разрывайте мышцы напрямую.
Бедренная кость мышей хрупкая. Поместите бедренную кость в 75% спирт на две-пять минут. Три. Инъекционную культуру BMDC промыть остаточным спиртом PBS.
Зажмите среднюю и нижнюю часть бедренной кости кровоостанавливающими щипцами, а нижний конец бедренной кости другим гемостатическими щипцами. Кровоостанавливающие щипцы наносятся буквально на бедренную кость, а бедренная кость отрывается от эпифизарной линии. Используйте один мл шприца для прокалывания полости костного мозга от эпифизарной линии.
Используйте полную среду двумя частями промывки полости костного мозга до тех пор, пока кость не станет белой. Собирайте промывочные жидкости. Дополняют полную среду, содержащую ГМ CSF/IL-4 до 24 мл, и высевают в 6-луночную пластину с 4 мл на лунку. Четыре.Результаты.
Через два дня замените все среды, содержащие GM-CSF/IL-4. Половина заменила полную среду, содержащую GM-CSF/IL-4, на четвертый, шестой и восьмой день. Количество клеток достигло пика на седьмой день, а затем постепенно уменьшалось.
Клетки DC образовали большое количество синапсов, демонстрирующих типичную зрелую морфологию клеток DC. Субметрические анализы потока показывают, что соотношение CD11c наложило то, что 71% на шестой день, широкое соотношение увеличилось до 96,1% на 10-й день. Экспрессия CD11c, CD80 и MSC2 постепенно увеличивалась с увеличением времени культивирования. Пять.Заключение.
Короче говоря, мы создали экономичный и эффективный протокол для выделения и генерации дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мышей, который занимает всего 10 минут для разделения клеток костного мозга. Большое количество ДК высокой чистоты было собрано после шести-семи дней культивирования с 10 нг на мл, GM-CSF и IL-4.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В данной статье представлен экономичный и эффективный метод для выделения и получения высокочистых дендритных клеток, полученных из костного мозга мышей. Протокол включает в себя 7-дневную культуру с GM-CSF/IL-4.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Клеточная биология
Фон
- Дендритные клетки (ДК) играют важную роль в исследованиях иммунитета к опухоли.
- ДК редки в тканях, что усложняет их выделение.
- Традиционные методы дифференцировки ДК сложны и затратны.
- Данное исследование направлено на упрощение процесса получения ДК из костного мозга.
Цель исследования
- Разработать экономичный метод выделения ДК.
- Повысить эффективность получения ДК из костного мозга мышей.
- Поддержать исследования в области иммунитета к опухоли, предоставляя высокочистые ДК.
Использованные методы
- Выделение костного мозга из костного мозга мышей.
- Культивирование клеток костного мозга с GM-CSF/IL-4.
- Оценка чистоты и жизнеспособности клеток.
- Одобрение Комитета по этике экспериментов на животных учреждения.
Основные результаты
- Успешное выделение высокочистых дендритных клеток, полученных из костного мозга.
- Доказанная эффективность нового протокола.
- Потенциал для более широкого применения в исследованиях иммунитета к опухоли.
- Снижение времени и затрат по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Разработанный метод является жизнеспособной альтернативой для получения ДК.
- Этот подход может способствовать дальнейшим исследованиям в области иммунологии.
- Будущие исследования могут изучить применения в различных терапевтических контекстах.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the bottleneck in dendritic cell supply for immunology and tumor immunity research by providing an economical, high-yield method for isolating bone marrow-derived dendritic cells from mice. It enables scalable generation of phenotypically characterized DCs with reduced reagent consumption and hands-on time, supporting early-stage target validation and mechanistic studies in immunotherapy pipelines. The approach improves predictive confidence in preclinical models by delivering a reproducible, disease-relevant system for evaluating immune modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell function in antigen presentation and T-cell activation pathways.
- Operational Value: Reduces cost and complexity of DC generation using standardized GM-CSF/IL-4 differentiation.
- Scientific Value: Supports functional target validation through phenotypic characterization of CD11c, CD80, and MHC II expression over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity dendritic cell populations (80%-95% CD11c+) suitable for standardized immune assays.
- Operational Value: Yields up to 2.7 x 107 cells per mouse, enabling high-throughput screening formats.
- Scientific Value: Provides a consistent biological system for assessing compound effects on dendritic cell maturation and immune function.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates a disease-relevant system for modeling dendritic cell responses in tumor immunity contexts.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of immunomodulatory agents with defined cellular inputs.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking dendritic cell phenotype to functional outcomes in co-culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a renewable source of dendritic cells for immune-focused assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on dendritic cell-dependent immune pathways and target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular outputs for assessing immunomodulatory activity.
- Analytics: Enables flow cytometry-based measurement of CD11c, CD80, and MHC II as maturation readouts.
- Translational Research: Connects in vitro dendritic cell generation to preclinical models of immune activation and tolerance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for dendritic cell production across immunology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through phenotypically defined dendritic cell inputs.
- Operational Value: Reduces time and cost via 10-minute bone marrow harvest and low cytokine dosing (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable dendritic cell models for immunotherapy screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates using standardized immune effector cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow isolation and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to 6-well plates, hemolytic forceps, and flow cytometry for phenotypic validation.
- Necessitates standardization of cytokine concentration and medium exchange schedule across users.
- Involves adaptation considerations when translating to other mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the 7–10 day culture window and associated decline in cell viability post-peak.
