Выделение эндотелиальных клеток мышиной сетчатки для секвенирования следующего поколения

Этот метод изоляции эндотелиальных клеток сетчатки позволит использовать передовые методы секвенирования для выявления новых механизмов развития сосудов. Описанный протокол оптимизирован для высоких степеней жизнеспособности и чистоты, которые необходимы для приложений секвенирования следующего поколения. Продемонстрировать процедуру будет Шелби Кейн, аспирант из лаборатории Херши.

Начните удалять глаза у усыпленной неонатальной мыши, отрезав кожу и мембрану над глазом перпендикулярным разрезом века с помощью ножниц для рассечения. Затем используйте щипцы, чтобы надавить сверху и ниже глаза, чтобы глаз двигался из гнезда. Осторожно зажмите под глаз щипцами и перережьте зрительный нерв, который держит глаз прикрепленным.

Затем поместите оба глаза мыши в колодец из 48-луночной тарелки в свежеприготовленный ледяной PBS до окончания сбора урожая. Чтобы изолировать ткань сетчатки мыши, подвешивайте глаза в подушечке для рассечения в чашке Петри, заполненной 500 микролитрами ледяного PBS, используя прокладку передаточной трубы с широким наконечником. Работая под рассеченным микроскопом, удерживайте зрительный нерв одним тонким щипцом и используйте вторые щипцы, чтобы проткнуть отверстие через переднюю камеру глаза, где соединяются роговица и склера.

Затем разорвите отверстие по кругу примерно на 75% пути вокруг роговицы. Удерживая зрительный нерв одним щипцом, используйте вторые щипцы, чтобы аккуратно оторвать склеру и стекловидное тело от ткани сетчатки. Чтобы удалить сосуды хрусталика и гиалоидного сплетения, доберитесь до сетчатки открытыми щипцами, пока почти не коснитесь ее, а затем закройте щипцы, чтобы схватить и вытащить сосуды хрусталика и подъязычно-подвздошного сплетения из сетчатки.

Когда все сосуды удалены, поместите сетчатку в двух миллилитровые микроцентрифужные трубки, заполненные 500 микролитрами одного x ледяного PBS. Удалите избыток PBS из двухмиллитровой микроцентрифужной трубки с помощью пипетки, оставив около 100 микролитров PBS в трубке, чтобы полностью покрыть ткань сетчатки. Затем добавьте в тюбик 500 микролитров свежеприготовленного раствора для пищеварения.

Используйте пипетту P1000 и наконечник пипетки для пипетки вверх и вниз по ткани сетчатки в растворе для пищеварения пять раз. Когда это будет сделано, инкубируйте смесь для пищеварения на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия в течение 20 минут с пипеткой смеси для пищеварения вверх и вниз каждые пять минут, как объяснялось ранее. После инкубации ткань сетчатки растворится в одноклеточную суспензию, делая смесь пищеварения мутной.

Затем гранулируют клетки центрифугированием при 375 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования удаляют PBS из промытой клеточной гранулы путем пипетирования, а затем иммунорафинируют клетки путем повторного использования гранулы в 100 микролитрах раствора для окрашивания антител на 0,5 раза 10 до шестых клеток. Инкубируйте одноклеточную суспензию с раствором для окрашивания антител в течение 30 минут на льду в темноте, постукивая по трубке каждые 10 минут, чтобы аккуратно перемешать клетки.

Для флуоресцентно-активированной сортировки клеток гранулируют клетки центрифугированием при 375 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта промыть и гранулировать клетки в 500 микролитров PBS, как описано ранее. А затем повторно суспендировать ячейки в 300 микролитрах флуоресцентно-активированной сортировки клеток или буфера FACS, осторожно смешивая с пипеттой.

Затем добавьте йодид пропидия или PI в качестве маркера жизнеспособности в пробирки, содержащие буфер FACS, чтобы получить конечную концентрацию 0,5 микрограмма на миллилитр. Используйте пипетку для переноса клеточных суспензий через защелкивающийся колпачок клеточного сетчатого фильтра, содержащий 35-микронный фильтр, в пятимиллилитровую пробирку. После фильтрации держите трубку FACS на льду в темноте, а затем перенесите трубку в сортировщик ячеек.

Включите прибор FACS и компьютер и откройте программное обеспечение FACS для запуска и эксплуатации прибора FACS. Выполняйте регулярные тесты контроля качества. Загрузите контрольные образцы пятен в прибор FACS для регулировки осей.

Начните с клеток только с антител IgG, чтобы генерировать и корректировать прямое рассеяние и боковое рассеяние. Затем антитело CD31 только для генерации и корректировки CD31. А затем антитело CD45 только для генерации и настройки CD45.

Запишите данные из контрольных образцов. Затем загрузите окрашенные ячейки образца в инструмент FACS и запустите образец. Походка по ячейкам на основе параметров прямого рассеяния или FSC и бокового рассеяния или SSC.

Клетки походки FSCA и FSCH для идентификации дублетов клеток и сбора только одиночных клеток. Клетки походки по PI и SSCA для идентификации жизнеспособных клеток. Сделайте CD31+CD45-походку с элементами управления Сделайте CD31+CD45-походку с элементами управления и походку по клеткам CD31 и CD45.

Вставьте в прибор коллекторную трубку с 250 микролитрами буфера FACS. Затем начните сортировку ячеек, которые являются CD31 + CD45- в установленной коллекторной трубке. Храните сборные трубки на льду для дальнейшего анализа.

Образцы могут быть обработаны для приложений секвенирования следующего поколения. В исследовании изменение времени пищеварения повлияло на выход клеток и процент жизнеспособности. Время пищеварения 20 минут привело к оптимальному выходу с низким процентом нежизнеспособных эндотелиальных клеток.

Последующее окрашивание пропидия йодидом показало, что изолированные эндотелиальные клетки оставались жизнеспособными в течение 60 минут после выделения. Чистота клеточной популяции оценивалась с помощью количественного анализа ПЦР или qPCRR экспрессии генов эндотелиальных клеток, показывающего сильное обогащение генов эндотелиальных клеток в популяции CD31 + CD45. Очистка РНК из изолированных эндотелиальных клеток, преобразующих и усиливающих кДНК посредством подготовки библиотеки и секвенирования Библиотека кДНК привела к более чем 16 000 генов, идентифицированных в девяти независимых образцах.

Падение транскриптов на миллион считываний или TPM наблюдалось в генах ниже этого порога. Секвенирование одноклеточной РНК изолированных эндотелиальных клеток сетчатки через 10-кратный конвейер геномики привело к медиане 1 171 гена на клетку, 15 247 обнаруженных генов и медиане 2 255 уникальных молекулярных идентификаторов или UMI на клетку в 917 клетках. Критическими шагами в этом протоколе являются изоляция ткани сетчатки и переваривание тканей, которые должны выполняться точно, как описано, для оптимизации выхода и жизнеспособности клеток.

Изолированные эндотелиальные клетки могут быть использованы в передовых методах секвенирования, таких как секвенирование РНК цельного транскриптома, секвенирование одноклеточной РНК, секвенирование иммунопреципитации хроматина и анализ для транспозазного секвенирования хроматина. Использование этого оптимизированного метода в сочетании с методами секвенирования следующего поколения и вычислительными подходами может дополнительно прояснить механизмы взаимосвязанных сигнальных путей, которые регулируют развитие сосудов.