Моделирование активного сайта фермента с помощью бесплатного программного обеспечения для молекулярной визуализации
25 декабря 2021 г.
Ключевым навыком в биомолекулярном моделировании является отображение и аннотирование активных сайтов в белках. Эта техника демонстрируется с помощью четырех популярных бесплатных программ для макромолекулярной визуализации: iCn3D, Jmol, PyMOL и UCSF ChimeraX.
Визуализация биологических макромолекул является критическим навыком для студентов и специалистов в области биологических наук. В этом протоколе мы демонстрируем, как моделировать активный сайт фермента глюкокиназы с помощью четырех свободно доступных программ для молекулярного моделирования. В этом учебнике освещаются несколько шагов протокола для каждой программы, которые включают в себя выбор связанных лигандов и использование лигандов для отображения аминокислот и молекул воды в пяти ангстремах.
Вспомогательная информация этой рукописи содержит специальное видео для каждой программы, в котором подробно описаны все этапы протокола с дальнейшим объяснением. Структура будет моделировать PDBID. 3ФГУ представляет собой каталитический комплекс фермента глюкокиназы.
Активный центр фермента связан с двумя его субстратами, бета-D-глюкозой, которая дала идентификатор BGC и ион магния, MG. Кроме того, этот аналог субстрата, фосфоаминофосфорная кислота, аденилатный эфир, ANP связывается с активным центром глюкокиназы. Этот негидролизуемый аналог аденозинтрифосфата АТФ предотвращает реакцию фосфорилирования, которая захватывает активный комплекс сайта прекатализа. Интерфейс программы моделирования UCSF ChimeraX содержит выпадающие меню, панель инструментов, средство просмотра структуры и командную строку.
Мы начнем протокол с шага 1.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта. Чтобы выбрать лиганды, нажмите контрольный сдвиг и нажмите на любой атом или связь в каждом из трех лигандов. Нажимайте клавишу со стрелкой вверх, пока все три лиганда не будут выделены зеленым свечением.
Определите выбор для будущего использования, щелкнув в раскрывающемся меню, выберите определить селектор, введите лиганды для имени выделения и нажмите кнопку «ОК». Опять же, с помощью меню выбора выберите зону. Переключите его на остатки и убедитесь, что установлен верхний флажок.
Нажмите кнопку ОК. Обратите внимание, что части мультфильма в пределах пяти ангстрем этих лигандов выделены. Чтобы отобразить боковые цепи в виде палочек и показать активный сайт молекул воды, используйте меню действий атомных связей, чтобы показать их.
Или включите их с помощью этих кнопок здесь. Чтобы очистить выделенную область, щелкните в любом месте пустого пространства. Конечным результатом этого протокола должна быть модель с активным центром белка и лигандами, показанными в виде палочек, окрашенных контрастным образом.
Ключевые полярно-связывающие взаимодействия показаны пунктирными линиями, а некоторые остатки, образующие контакты, помечены. Интерфейс iCn3D содержит выпадающие меню, средство просмотра структуры и журнал команд. В этом представлении отображаются всплывающие меню выборочных наборов, последовательностей и аннотаций, которые появляются, когда пользователь выполняет необходимые команды.
Мы начнем протокол на шаге 2.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта. Чтобы выбрать лиганды, используйте раскрывающееся меню выбора и нажмите выбрать на 3D, убедитесь, что остаток отмечен. Удерживая кнопку alt на ПК или кнопку опции на Mac, нажмите на первый лиганд.
Затем нажмите control и нажмите на оставшиеся два лигана, чтобы добавить их в выбор. Сохраните выделенный фрагмент с помощью раскрывающегося меню, нажмите кнопку выбрать, сохраните выделение, введите имя и нажмите кнопку сохранить. Появится всплывающее меню выбора наборов с тремя выбранными лигандами.
Теперь выделите остатки в пределах пяти ангстрем лигандов. Используйте раскрывающееся меню, выберите по расстоянию. Во всплывающем меню измените копье второго элемента с радиусом на пять ангстрем, набрав блок, нажмите кнопку Отображение.
Затем закройте окно, щелкнув значок X в правом верхнем углу. Сохраните пять активных сайтов angstrom, щелкнув раскрывающееся меню, выберите Сохранить выделенную область и с помощью клавиатуры введите имя. Затем нажмите кнопку Сохранить.
Теперь создайте новую выделенную область, объединяющую два набора. Их можно комбинировать во всплывающем меню выбора наборов. На ПК можно нажать на два набора или на Mac щелкнуть командой.
Снова щелкните раскрывающееся меню, выберите Сохранить выделенную область, введите новое имя, а затем нажмите кнопку Сохранить. Чтобы показать взаимодействия, такие как водородные связи, используйте меню анализа и выберите взаимодействия. Здесь нас будут интересовать только водородные связи и соляные мосты.
Поэтому мы снимем все остальные. Мы выберем три лиганда. А для второго набора остатки в пределах пяти ангстрем.
Щелкните Взаимодействия с 3D-дисплеем и закройте окно. Это показывает некоторые из остатков, которые взаимодействуют, но не показывает весь активный сайт ангстрема. Чтобы отобразить это, снова используйте меню выбора наборов.
Нажмите на пять полных ангстрем, а затем в выпадающем меню нажмите стиль боковых цепочек, палок. Чтобы применить раскраску CPK, нажмите на раскрывающееся меню цвета и нажмите атом. Конечным результатом протокола должна быть модель, которая выглядит так с активным сайтом белка и лигандом, показанным в виде палочек, окрашенных контрастным образом.
Важные взаимодействия привязки показаны пунктирными линиями, и все остатки в одном из выделений, созданных во время протокола, помечаются. Интерфейс Jmol содержит выпадающие меню, панель инструментов, средство просмотра структуры, всплывающее меню и консоль Jmol, содержащую командную строку. Мы начинаем протокол Jmol на шаге 3.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта.
Консоль Jmol — лучший способ выбора остатков в пределах пяти ангстрем. Введите эту команду, чтобы выбрать остатки в пределах пяти ангстрем из трех лигандов. Выбрано 193 атома, но они не представляют собой полные аминокислотные остатки.
Чтобы выбрать их, используйте введенную команду, выберите внутри(группа, выбрано) и нажмите клавишу ВВОД. Обратите внимание на появление дополнительных ореолов выделения. Чтобы отобразить эти остатки в виде палочек, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы открыть всплывающее меню, наведите указатель мыши на стиль, схему, а затем нажмите «Палочки».
Обратите внимание, что здесь все еще есть некоторые пустые ореолы. Это молекулы воды в активном центре. Чтобы выбрать только молекулы воды, мы можем повторно выполнить эту команду, а затем изменить ее.
Щелкните внутри консоли, затем с помощью клавиш со стрелками вверх найдите эту команду и нажмите клавишу ВВОД, чтобы повторно выполнить ее. Чтобы отобразить молекулы воды в виде атомов, мы хотим удалить выделение лиганда и белка. Для этого мы введем две команды.
Наши лиганы считаются гетерогруппами, но вода также считается одной. Таким образом, в рамках этой команды нам нужно определить, что мы не удаляем воду. Нажмите enter и теперь выбираются только молекулы воды.
Нажмите на раскрывающееся меню, наведите курсор на атом и выберите 20% радиуса ван-дер-Ваальса. Зеленый ион магния по-прежнему показан в виде палочек. Чаще всего ионы показаны в виде сфер.
Щелкните в консоли Jmol и введите select MG, а затем заполните пробел 50%Лиганды внутри цепочек окрашены одинаково. Чтобы отличить их друг от друга, полезно перекрасить лиганды. В консоли я выполню многострочную команду, которую я скопировал-вставил из шпаргалки, о которой я подробно рассказываю в дополнительном видео Jmol.
Результатом этого протокола должна быть модель, которая выглядит так с активным сайтом белка, показанным в виде палочек. А лиганды показали нам палочки в более мягкой цветовой гамме. Желтыми линиями обозначены взаимодействия связывания, а отдельные остатки помечены по желанию.
Интерфейс PyMOL содержит раскрывающиеся меню, средство просмотра структуры, панель имен объектов и меню элементов управления мышью. Основная командная строка также обозначена на этом рисунке. Мы начинаем первичный протокол на шаге 4.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта.
Чтобы выбрать лиганды, нажмите на каждый из них. Появится новый выбор, который можно переименовать, нажав кнопку A. С помощью клавиатуры удалите буквы sele и наберите вместо них ligans.
Нажмите клавишу ВВОД. Мы можем использовать этот выбор для определения области вокруг него. Начните с нажатия кнопки A и выберите дубликат пункта меню.
В этом новом выборе sel01 щелкните A и выберите пункт меню переименования. С помощью клавиатуры удалите существующие буквы и введите active. Это все еще выбор наших трех лигандов, поэтому нам придется изменить его снова, используя кнопку действий A.
Нажмите кнопку, выберите «Изменить» и разверните выделение на пять ангстрем. Теперь мы захватили лиганды и остатки в пределах пяти ангстрем. Кнопка S на S означает шоу.
Нажмите на это, чтобы отобразить белок по-разному. Мы покажем эту солодку в виде палочек. Щелкните в пустом месте, чтобы очистить выделенную область.
Это захватило аминокислоты в пределах пяти ангстрем, но не воду. Мы можем снова, продублировать выделение и теперь изменить его, чтобы выбрать только воду. В действиях кнопки A продублируйте.
Появится выбор 2. Давайте переименуем это в активную воду. На этот раз мы будем использовать кнопку A для изменения, чтобы выбрать атомы вокруг нашего выбора.
Атомы в пределах четырех ангстрем. Это выбрало воду, а также некоторые атомы боковых цепей. Чтобы изменить это дальше, используйте кнопку A для изменения и ограничения сольвентом.
Теперь мы можем видеть, что только молекулы воды загораются. Опять же, в кнопке A мы можем применить пресет. Выберите предустановку, шарик и палку, и теперь молекулы воды отображаются в виде сфер.
Конечным результатом протокола является модель, которая выглядит так с активным сайтом в лигандах, показанным в виде палочек, окрашенных контрастным образом. Желтые линии тире показывают полярно-связывающие взаимодействия, а отдельные остатки помечаются с помощью выделенных областей, созданных на панели объектов «Имена». Ошибки в исполнении протокола могут привести к неоптимальным результатам.
Например, весь белок отображается в виде палочек. Для устранения неполадок пользователю сначала нужно будет скрыть представление палочки для всей структуры. А затем повторно отобразить представление джойстика только для объекта, называемого активным, с помощью кнопки S.
Здесь модели, сгенерированные с помощью каждой программы, показаны рядом. Хотя существуют различия в отображении фермента, одни и те же ключевые особенности и взаимодействия можно увидеть в каждой из четырех моделей. Пользователь, заинтересованный в освоении одной из программ, содержащих командную строку, хочет научиться применять и изменять введенные команды.
Как я упоминал в протоколе Jmol, полезным инструментом является командная шпаргалка. Обычный текстовый файл, содержащий часто используемые коды для ссылки. Чтобы стать продвинутым пользователем, полезно понять, какие части протокола могут быть адаптированы и изменены.
С практикой эти протоколы могут быть применены для моделирования любого ферментного активного сайта, представляющего интерес.
Обзор
В данной статье демонстрируются навыки биомолекулярного моделирования путем визуализации активного центра фермента глюкокиназы с использованием четырех бесплатных программ: iCn3D, Jmol, PyMOL и UCSF ChimeraX. Руководство содержит пошаговые инструкции по моделированию и аннотированию активного центра с присоединенными лигандами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомолекулярное моделирование
- Визуализация белков
- Анализ активного центра фермента
Теоретическая часть
- Понимание структуры белков имеет решающее значение в биологических науках.
- Активные центры необходимы для функционирования ферментов и их взаимодействия с субстратами.
- Для визуализации макромолекул доступно различное программное обеспечение.
- Данное исследование посвящено глюкокиназе — ферменту, участвующему в метаболизме глюкозы.
Цель исследования
- Обучить исследователей методам эффективного моделирования активных центров ферментов.
- Сравнить различные инструменты молекулярной визуализации.
- Предоставить подробное руководство по выбору и отображению лигандов и остатков.
Используемые методы
- Использование iCn3D, Jmol, PyMOL и UCSF ChimeraX для моделирования.
- Пошаговый протокол выбора остатков в радиусе пяти ангстрем от лигандов.
- Визуализация аминокислот и молекул воды, расположенных вблизи лигандов.
- Аннотирование ключевых взаимодействий и структурных особенностей.
Основные результаты
- Успешное моделирование активного центра глюкокиназы со связанными лигандами.
- Четкая визуализация взаимодействий между ферментом и субстратами.
- Демонстрация возможностей каждого программного инструмента.
- Создание подробного обучающего видео по каждой программе.
Выводы
- Данное исследование предоставляет ценные сведения о методах биомолекулярного моделирования.
- В нем подчеркивается важность программного обеспечения в структурной биологии.
- Исследователи могут эффективно визуализировать и анализировать активные центры ферментов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Биомолекулярная визуализация позволяет проводить валидацию мишени, выявляя структурные детерминанты связывания лиганда и функционирования фермента. Моделирование активных центров способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска новых соединений за счет уточнения взаимосвязей между структурой и функцией. Данный навык повышает прогностическую достоверность в процессах идентификации соединений-лидеров и разработки методов анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации взаимодействий при связывании лиганда в активном центре глюкокиназы.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет идентификации ключевых аминокислотных остатков и молекул воды, участвующих в распознавании субстрата.
- Прогностическая ценность: облегчает приоритизацию портфеля препаратов, предоставляя структурные данные, которые ложатся в основу оценки уверенности в мишени и ее пригодности для лекарственного воздействия.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических моделей для последующего скрининга путем определения остатков активного центра в пределах пяти ангстрем от связанных лигандов.
- Практическая ценность: Содействие стандартизации и воспроизводимости анализа за счет единообразной визуализации взаимодействий связывания в iCn3D, Jmol, PyMOL и UCSF ChimeraX.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для кампаний по скринингу благодаря предоставлению переносимых протоколов моделирования любого интересующего активного центра фермента.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает структурные данные, полученные на этапе первичного поиска, с доклинической валидацией путем обеспечения согласованности моделирования активного центра на всех этапах рабочих процессов.
- Снижение механистических рисков: акцентирует внимание на полярных связях и маркировке остатков для поддержки дизайна на основе структуры и оптимизации ведущих соединений.
- Клиническая значимость: моделирует человеческую глюкокиназу — ключевой фермент метаболизма глюкозы, имеющий значение для программ разработки препаратов для лечения диабета и метаболических нарушений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений — обеспечивая возможность структурного анализа комплексов фермент-лиганд.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет визуализации связывания лигандов с активным центром глюкокиназы.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа посредством стандартизированного отбора и отображения остатков и молекул воды, находящихся в непосредственной близости от лигандов.
- Аналитика: формирует количественные структурные данные, такие как визуализация водородных связей и маркировка остатков, что помогает в сравнении режимов связывания лигандов.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом, предоставляя многократно используемую основу для моделирования активных центров ферментов в системах, имеющих значение для конкретных заболеваний.
- Корпоративное использование: создает масштабируемую возможность моделирования любого активного центра фермента, что сокращает необходимость в повторном обучении и повышает согласованность работы между различными группами исследователей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности при валидации мишеней, снижение механистической неопределенности в взаимодействиях фермент-лиганд.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и кроссплатформенная согласованность биомолекулярной визуализации.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), повышение эффективности использования капитала на ранних стадиях поиска и снижение биологических рисков при оптимизации соединений-лидеров.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с учетом рисков на основе структурной достоверности и доступности сайта связывания.
Рекомендации по внедрению
- Требуются базовые знания в области структурной биологии и белок-лигандных взаимодействий.
- Необходим доступ к вычислительной инфраструктуре, поддерживающей работу iCn3D, Jmol, PyMOL или UCSF ChimeraX.
- Требуется стандартизация протоколов визуализации между исследовательскими группами для обеспечения единообразной интерпретации моделей активного центра.
- При применении протокола к различным ферментным системам или типам лигандов необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Эффективность ограничена уровнем владения пользователем интерфейсами командной строки и инструментами выделения в четырех программных платформах.
