Идентификация источника секретируемых белков в почках с помощью инъекции Брефельдина А

Наш метод позволяет нам определить источник и относительный вклад цитокиновых клеток в поврежденных почках. Использование брефельдина А для предотвращения секреции белка позволяет нам собрать больше информации о клетках, продуцирующих цитокины в солидных органах, такой как тип клеток и состояние этих клеток.

Наш протокол должен быть легко адаптируемым ко многим системам органов. Поскольку брефельдин А является проницаемой для клеток малой молекулой, он должен ингибировать секрецию в большинстве типов клеток, что позволяет обнаруживать цитокины и другие секретируемые белки.

Инъекция копчика является наиболее технически сложным этапом, потому что копчик мыши довольно маленький. Мы рекомендуем отрабатывать этот шаг перед выполнением нашего протокола на подопытных животных.

[Инструктор] Начните с того, что поставьте клетку наполовину, наполовину снимите грелку на 10 минут, чтобы мышам было тепло. Поместив мышь в удерживающее устройство, продезинфицируйте хвост с помощью повидон-йода и спиртового тампона три раза. Держите хвост горизонтально и визуализируйте боковые хвостовые вены. Затем введите иглу 28 калибра, держа иглу и шприц параллельно вене по направлению головки. Введите 200 микролитров раствора БФА из расчета 1,25 миллиграмма на миллилитр. Вена должна стать чистой по мере того, как кровь заменяется раствором для инъекций. Затем извлеките иглу и аккуратно надавите на хвост до тех пор, пока кровотечение не остановится. Верните мышей в клетку и следите за ними на предмет дополнительного кровотечения или признаков дистресса. Используйте шприц объемом 20 миллилитров и перфузируйте мышь от 10 до 20 миллилитров PBS через левый желудочек со скоростью потока от двух до четырех миллилитров в минуту до тех пор, пока перфузат не станет прозрачным. Удалите почки, удерживая почечную артерию и вену близко к сосочку и разрезав сосуд сбоку от почки. Затем аккуратно извлеките капсулу из почки, отклеив ее вручную или с помощью пары тонких стерильных щипцов. Используйте маркер с гидрофобным барьером и обведите контуром участки ткани, сохраняя расстояние не менее пяти миллиметров от ткани до контура гидрофобного барьера. Затем добавьте 50 микролитров блокирующего буфера, содержащего 3% ослиной сыворотки и 0,1% тритона в 1% бычьего сывороточного альбумина TBS сверху на секцию. Выдержать при комнатной температуре в течение часа во влажной камере. Разведите первичные антитела с PBS в соответствующей концентрации. Для обнаружения цитокинов разведите антитела, направленные против TGF beta one, PDGF-D или CTGF, в 50 микролитрах PBS. Добавьте первичное антитело Anti-Alpha SMA, конъюгированное с Cy3, в раствор первичного антитела в разведении 1:200 для мечения миофибробластов. Удалите блокирующий буфер и добавьте первичные антитела в секцию, следя за тем, чтобы она не вытекала из круглого гидрофобного контура. Инкубировать в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия во увлажненной камере. Выньте увлажненную камеру из инкубатора и промойте предметные стекла с ПБС трижды в течение пяти минут. Затем разбавьте соответствующие вторичные антитела в соотношении один к 200 с PBS. Инкубируйте образцы с 50 микролитрами растворов вторичных антител в течение часа при комнатной температуре во увлажненной камере. Выньте предметные стекла из увлажненной камеры и промойте PBS в течение пяти минут. Разводить лектин lotus tetragonolobus, конъюгированный с флуоресцеином в PBS с кальцием и магнием в концентрации 10 мкг на миллилитр. Затем инкубируйте ткани с 50 микролитрами раствора LTL в течение 30 минут при комнатной температуре в увлажненной камере. Выньте предметные стекла из увлажненной камеры и промойте их PBS с кальцием и магнием в течение пяти минут. Инкубируйте ткани с 50 микролитрами DAPI, чтобы окрашивать ядра ДНК в течение пяти минут при комнатной температуре. Постирайте один раз с PBS. Добавьте 20 микролитров реагента для монтажа защитного стекла в ткань для крепления покровных стеблей, а затем медленно установите покровное стекло. Подождите 24 часа, пока реагент против выцветания затвердеет перед визуализацией. Включите инвертированный микроскоп с автоматическим двухкоординатным столиком и выберите объектив с 20-кратным увеличением. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и найдите срез ткани. Затем откройте программное обеспечение для получения изображений и нажмите «В реальном времени», чтобы открыть окно просмотра в реальном времени. Найдите участок ткани, убедившись, что он находится в фокусе. Нажмите на меню «Получить» и выберите «Сканировать большое изображение». Настройте область для сканирования, переместив рабочую область с помощью джойстика в крайнюю левую часть участка ткани, а затем нажмите стрелку влево. Повторите то же самое для верхнего, самого правого и нижнего сегментов тканей. Нажмите на меню сбора данных и убедитесь, что установлен флажок для многоканального захвата. Чтобы получить многоканальные изображения, нажмите на вкладку лямбда, нажмите на каждый канал и установите время экспозиции на уровне, при котором окрашивание будет заметным без насыщения какой-либо части изображения. Повторите это для каждого канала, который нужно собрать. Затем нажмите «Сканировать». Откройте программу для получения изображений и нажмите «Файл». Затем нажмите «Открыть» и выберите изображение. Щелкните правой кнопкой мыши по окну изображения и выберите Polygonal ROI. Наметьте рентабельность инвестиций с помощью инструмента от руки. Затем наметьте LTL-положительные клетки канальцев или альфа-SMA-положительные интерстициальные клетки. Нажмите на вкладку измерения, а затем пороговое значение. Установите верхний и нижний пороговые пределы, отрегулировав ползунки по обе стороны от области положительного сигнала. Затем перейдите на вкладку ROI. Наконец, нажмите на значок экспорта, чтобы сохранить значения. Используйте программное обеспечение для работы с электронными таблицами для расчета процентного соотношения положительного сигнала по площади ROI.

[Ведущий] Бета-положительные везикулы TGF на третий день после введения цисплатина или физиологического раствора показаны на репрезентативных изображениях. Бета-положительные везикулы TGF наблюдаются в ПТЦ, меченных LTL, в почках, получающих цисплатин, в присутствии БЖК. Тем не менее, эти везикулы не наблюдались в неповрежденных почках или в необработанных почках с БФА.

[Инструктор] Модификация выявила увеличение бета-положительной площади TGF при лечении БФА при остром повреждении почек, вызванном цисплатином. Как и в случае с TGF beta, PTGF-D-положительные везикулы или CTGF-положительные везикулы также накапливались при лечении BFA в цисплатин-индуцированном ОПП. Количественное определение показало, что PDGF-D-положительные и CTGF-положительные области также были значительно увеличены при использовании BFA В LTL-положительных клетках проксимальных канальцев инъекция BFA не привела к значительному повышению уровня мочевины в плазме крови на третий день после инъекции цисплатина. Бета-положительные везикулы TGF наблюдались в меченных альфа СМА интерстициальных клетках цисплатина ОПП при лечении БФА. Модификация показала, что бета-положительные области TGF в альфа-СМА-положительной области были значительно увеличены при лечении BFA цисплатином ОПП. Подобно бета-положительным везикулам TGF, CTGF-положительные везикулы также увеличивались при лечении BFA. Количественное определение показало, что лечение БЖК увеличивает отношение положительной площади CTGF к положительной площади альфа-СМА при цисплатин-индуцированном ОПП. По сравнению с цисплатин-индуцированным повреждением, TGF-бета-положительные везикулы в ПТК были значительно меньше в хронической фазе АА. Наблюдалось минимальное положительное окрашивание при LTL-положительных ПТК. Тем не менее, интенсивность сигнала TGF beta в молекуле первого положительного ПТК при повреждении почек была увеличена при лечении БФА. Средний уровень интенсивности TGF beta был в три раза выше при введении БФА, чем без БФА.

Наиболее важным этапом является обеспечение успешной инъекции в хвостовую вену. Неудачная инъекция могла привести к искажению результатов. Поэтому, пожалуйста, ищите признаки успеха, такие как прозрачная вена после инъекции, и пожалуйста, ищите признаки неудачи, такие как отек над хвостами.

Инъекцию Брефельдина А можно сочетать с рядом анализов, включая вестерн-блоттинг или проточную цитометрию для оценки продукции цитокинов в масштабе органа или отдельной клетки.

Используя этот метод, мы смогли идентифицировать новые цитокины, секретируемые эпителиальными клетками почек, которые, как считалось ранее, происходят из других типов клеток. Он может быть использован для разрешения давних споров о вкладе конкретных типов клеток в травму.