Микрофлюидный акустофорез для сквозного разделения грамотрицательных бактерий с использованием аффинных шариков Аптамера
17 октября 2022 г.
В данной работе описывается изготовление и эксплуатация микрофлюидных акустофоретических чипов с использованием метода микрофлюидного акустофореза и модифицированных аптамерами микрошариков, которые могут быть использованы для быстрого и эффективного выделения грамотрицательных бактерий из среды.
Этот протокол описывает нашу технологию микрофлюидного акустофореза, которая может быть использована для быстрого и эффективного отделения грамотрицательных бактерий от среды с использованием модифицированных аптамерами микрошариков. Системы микрофлюидного акустофореза позволяют разделять грамотрицательные бактерии с разумной пропускной способностью и бесконтактной изоляцией клеток. Микрофлюидный акустофорез может быть оптимизирован для выделения бактерий из медицинских образцов и образцов окружающей среды.
Для начала разработайте микрофлюидный чип акустофореза, который собирает ШАРИКИ PS на целевом выходе и отбрасывает остальные после введения смеси образца PS во входное отверстие образца. Подготовьте чип со слоями выше и ниже слоя кремния, связанными с боросиликатным стеклом. А третий слой боросиликатного стекла, используя анодирование, добавляют 1000 вольт и 400 градусов Цельсия.
Прикрепите PZT к боросиликатному стеклянному слою вдоль микрофлюидного канала, используя менее 10 микролитров цианоакрилатного клея. Инокулируют бактерии GN и GP в среде Лурия-Бертани и инкубируют ее при 37 градусах Цельсия и 220 оборотах в минуту в течение 16 часов. Центрифугируйте культивируемые бактерии при 9 056 RCF в течение одной минуты при комнатной температуре.
Затем дважды промыть буфером 1X PBS. Подготовьте выбранные бактерии GN и GP к анализу, повторно разместив их в буфере связывания. Перед использованием повторно используйте 10-микрометровую смесь микрошариков со стрептавидиновым покрытием.
Вращайте смесь в течение 20 секунд. Приготовьте аптамер, денатурируя его при 95 градусах Цельсия в течение трех минут, а затем повторно складывая его при нуле градусов Цельсия в течение двух минут. Переложите 250 микролитров повторно суспендированной смеси микрошариков с покрытием стрептавидин в трубку объемом 1,5 миллилитра и добавьте в трубку 100 микролитров биотинилированного аптамера ДНК.
Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 30 минут, вращая со скоростью 25 оборотов в минуту. Центрифугируют реакционную смесь при 9, 056 RCF в течение 40 секунд при комнатной температуре. Затем дважды промыть трубку 200 микролитрами буфера Tris-HCl.
Добавьте 10 микролитров по 100 миллиграммов на миллилитр BSA в промытую пробочку и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, вращаясь со скоростью 25 оборотов в минуту. Наконец, дважды промывайте модифицированные аптамером микрошарики в буфере Tris-HCl центрифугированием при 9 056 RCF в течение 40 секунд при комнатной температуре. Подключите трубки PEEK к двум входным отверстиям для впрыска двух образцов и буфера, а также к двум выходам для сбора и сброса отходов.
Используя шприц объемом 10 миллилитров, заполните канал микрофлюидного акустофореза безпузырьковой деминерализованной водой. Подготовьте прецизионный регулятор давления с двумя или более выходными каналами для управления потоком жидкости. После подготовки устройства вводят образец и буфер, применяя давление двух килопаскалей к входу образца и четырех килопаскалей к буферному входу с помощью прецизионного устройства контроля давления.
С помощью микроскопа сосредоточьтесь на шарике и переместите его к центру микрофлюидного канала с помощью PZT. Генерируйте резонансную частоту 3,66 мегагерца с помощью генератора одноканальной функции и усиливайте типичный сигнал на 16 децибел с помощью усилителя мощности. Наблюдайте за процессами разделения и обогащения на акустофлюидном чипе с помощью флуоресцентного микроскопа и высокоскоростной камеры, работающей со скоростью 1 200 кадров в секунду.
Акустофоретический чип, представленный в этом исследовании, подтвердил, что по мере увеличения напряжения PZT центральная концентрация бусин размером 10 микрометров увеличивалась. При пяти вольтах напряжения PZT большая часть шариков размером 10 микрометров была сосредоточена в центре. Отношение количества бусин, собранных на выходе, к общему количеству введенных бусин размером 10 микрометров называлось скоростью восстановления.
Отношение количества бусин размером 10 микрометров к общему количеству собранных бусин называлось чистотой. Результаты показали, что устройство имело высокую эффективность разделения для бусин размером 10 микрометров. Количество бактерий GN и GP, связанных с каждой модифицированной микрошарикой аптамера, измерялось с помощью микроскопа с высокоскоростной камерой.
Все пять бактерий GN были связаны с шариками, в то время как значительно меньше бактерий GP были связаны с тестируемыми веществами. Сила сигнала значительно различалась между бактериями GN и GP. Клей, используемый для крепления PZT, должен использоваться как можно меньше для точности гофрирования, а PZT и микроканал должны быть параллельными.
Этот прибор может быть использован для обнаружения живых бактерий или биомаркеров бактерий, полученных в период ранней диагностики бактериальных инфекционных заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена технология микрофлюидного акустофореза для быстрого и эффективного отделения грамотрицательных бактерий из различных сред. В методе используются модифицированные аптамерами микросферы для оптимизации процесса изоляции, что позволяет осуществлять бесконтактное разделение клеток с приемлемой пропускной способностью.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микрофлюидика
- Акустофорез
- Микробиология
Теоретические основы
- Микрофлюидные системы позволяют осуществлять точное манипулирование жидкостями на микроуровне.
- Акустофорез — это метод, использующий акустические волны для манипулирования частицами.
- Грамотрицательные бактерии создают значительные трудности при выделении из-за своих структурных особенностей.
- Аптамеры представляют собой короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, способные селективно связываться со специфическими мишенями.
Цель исследования
- Разработать микрофлюидный чип для акустофореза с целью эффективного разделения бактерий.
- Оптимизировать процесс изоляции как для медицинских, так и для экологических образцов.
- Продемонстрировать эффективность микросфер, модифицированных аптамерами, в повышении эффективности разделения.
Используемые методы
- Проектирование микрофлюидного чипа для акустофореза.
- Склейка слоев кремния и боросиликатного стекла для изготовления чипа.
- Введение смеси образцов ПС в чип для разделения.
- Проведение анодирования при заданных значениях напряжения и температуры.
Основные результаты
- Микрофлюидная система акустофореза успешно изолировала грамотрицательные бактерии.
- Были достигнуты высокая пропускная способность и бесконтактное разделение.
- Микросферы, модифицированные аптамерами, значительно повысили эффективность изоляции.
- Данный метод применим как к медицинским, так и к экологическим образцам.
Выводы
- Микрофлюидный акустофорез является перспективным методом изоляции бактерий.
- Модификации аптамерами повышают селективность и эффективность процесса.
- Данная технология может быть полезна для различных применений в микробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод микрофлюидного акустофореза обеспечивает быстрое и высокочистое выделение грамотрицательных бактерий из сложных матриц, устраняя критический пробел в ранней диагностике инфекционных заболеваний и экологическом мониторинге. Благодаря сочетанию безметочного акустического разделения со специфичностью на основе аптамеров, эта технология способствует снижению рисков при поиске новых противомикробных средств и в рабочих процессах валидации биомаркеров. Продемонстрированный выход >98% и чистота 97,8% при 10-кратном концентрировании представляют собой масштабируемую бесконтактную альтернативу центрифугированию или фильтрации для доклинической подготовки проб.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней грамотрицательных бактерий путем выделения живых патогенов из гетерогенных биологических или environmental образцов.
- Практическая ценность: сокращает время обработки образцов и минимизирует повреждение биомолекул по сравнению с традиционными методами сепарации.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков, обеспечивая получение очищенных бактериальных фракций для изучения взаимодействия с мишенью и механизмов действия.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение очищенных бактериальных компонентов для анализов фенотипического скрининга, что снижает количество ложноположительных результатов, вызванных загрязнением грамположительными видами.
- Практическая ценность: стандартизация подготовки образцов за счет воспроизводимой акустофоретической фокусировки и захвата с помощью аптамеров.
- Масштабируемость: конструкция с раздвоенным каналом позволяет проводить одновременную обработку, очистку и концентрирование, что обеспечивает более высокую пропускную способность в каскадах скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Обеспечивает связь между этапами фундаментальных исследований и доклинических испытаний за счет возможности стабильного выделения грамотрицательных бактерий из матриц, имитирующих клинические образцы, таких как кровь или моча.
- Соответствие биомаркеров: Облегчает обнаружение живых бактерий или производных биомаркеров при разработке методов ранней диагностики, поддерживая создание трансляционных биомаркеров.
- Развитие с учетом рисков: Высокие показатели выхода и чистоты повышают достоверность результатов последующих анализов, используемых для оценки ведущих соединений.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум от раннего поиска до доклинических исследований, в частности, обеспечивая подготовку образцов для валидации мишеней, проверки готовности анализа и механистических исследований, где критически важна чистота грамотрицательных бактерий.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез путем выделения специфических грамотрицательных штаммов из смешанных культур или образцов окружающей среды для снижения рисков при работе с целевыми объектами.
- Скрининг: Позволяет получать бактериальные популяции, готовые к анализу, с минимальным переносом мешающих компонентов, что повышает точность скрининга.
- Аналитика: Обеспечивает количественные данные с помощью флуоресцентной микроскопии и высокоскоростной визуализации, позволяя оценивать соотношение связывания бусин с бактериями и сравнивать интенсивность сигнала.
- Трансляционные исследования: Интегрируется в доклинические рабочие процессы, обеспечивая выделение из медицински значимых образцов, что поддерживает преемственность при разработке моделей инфекционных заболеваний.
- Промышленное использование: Конструкция на базе чипа и жидкостная система с контролем давления позволяют стандартизировать процессы между лабораториями и адаптировать метод к различным типам образцов без необходимости перепроектирования.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности, вызванной примесями в образцах.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость благодаря точному контролю акустической силы и стандартизированной подготовке аптамер-гранул.
- Стратегическая ценность: повышает надежность принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») в программах создания антимикробных препаратов за счет получения высокоточных биологических входных данных.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию перспективных соединений с учетом рисков на основе более чистых механистических данных, полученных из очищенных бактериальных фракций.
Особенности реализации
- Требуется опыт в проектировании микрофлюидных устройств, оптимизации параметров акустофореза и протоколов конъюгации аптамеров с микросферами.
- Необходимы пьезоэлектрические преобразователи, генераторы функций, усилители мощности и флуоресцентный микроскоп с возможностью высокоскоростной съемки.
- Необходима стандартизация условий буфера, скоростей потока (2 kPa для образца, 4 kPa для буфера) и калибровка напряжения PZT для всех пользователей.
- Адаптация к различным видам бактерий или матрицам образцов может потребовать повторной оптимизации подбора аптамеров и частоты акустического резонанса.
- Практические ограничения включают гофрирование каналов из-за использования избытка цианоакрилата, что влияет на равномерность акустического поля.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
