Моделирование внутрижелудочкового кровоизлияния новорожденных посредством внутрижелудочковой инъекции гемоглобина

Этот протокол важен, потому что мы разрабатываем клинически значимую модель IVH-индуцированной черепно-мозговой травмы и гидроцефалии, используя инъекцию гемоглобина в желудочки, что позволяет впоследствии количественно определять объемы желудочков в приложении для тестирования новых терапевтических стратегий. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет изучать патологию ИВГ, которая специфически опосредована гемоглобином и препаратами распада крови по железному пути. Эта техника также проста в использовании и универсальна.

Последствия этого метода распространяются на разработку методов лечения постгеморрагической гидроцефалии, поскольку он позволяет лучше понять патофизиологию IVH и оценить клинически значимые стратегии лечения для профилактики неврологических последствий после IVH. Продемонстрировать процедуру будет Шрути Рамагири, ассоциированный постдок из Австралийской лаборатории. Для начала поместите обезболенную крысу, склонную к стереотаксическому аппарату, с ее носом, расположенным в адаптере анестезии.

Затем закрепите голову, затянув неразорвавшиеся ушные вкладыши на внешнем слуховом проходе. Чтобы очистить голову, сначала прикоснитесь к стерильному аппликатору с хлопковым наконечником, пропитанному бетадином в центре головы, и выйдите наружу, чтобы распределить бетадин по кругу. Затем повторите процесс с помощью аппликатора, пропитанного 70% этанолом.

Далее, используя скальпель, сделайте 0,3-сантиметровый разрез вертикально вниз по центру головы, чтобы обнажить брегму черепа. Затем высушите область с помощью аппликатора с хлопковым наконечником. Чтобы настроить стереотаксический инжектор, втяните предварительно приготовленный раствор гемоглобина в шприц объемом 0,3 или 0,5 миллилитра и поместите шприц в стереотаксическую инжекторную систему.

Затем включите интерфейс стереотаксического инжектора и нажмите кнопку конфигурации, чтобы ввести громкость впрыска и настройки скорости. Нажмите на громкость и установите объем на 20 000 нанолитров. Затем нажмите на скорость инфузии и установите скорость в 8 000 нанолитров в минуту.

Нажмите кнопку сброса положения, чтобы выйти из конфигурации. Промойте кончик иглы, нажав кнопку наполнения, пока на кончике иглы не появится небольшая бусина гемоглобина, затем используйте аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы аккуратно удалить бусину. Чтобы начать инъекцию животному, установите брегму как ноль на стереотаксической системе инъекции, регулируя медиолатеральное и переднезаднее положения шприца.

Затем опустите шприцевую иглу, чтобы осторожно коснуться черепа у брегмы. После определения координат выбора поднимите шприцевую иглу на один сантиметр выше черепа, чтобы очистить кожу головы. Установите медиолатеральные и переднезадние координаты.

Затем опустите шприц, чтобы игла осторожно коснулась черепа и установила дорсовентральную координату в течение 30 секунд. После того, как координаты установлены, начните внедрение, нажав кнопку запуска на интерфейсе стереотаксического инжектора. После того, как инъекция закончена, оставьте иглу на месте в течение двух минут, чтобы свести к минимуму обратный поток раствора.

Далее медленно выведите шприц вдоль дорсовентральной координаты в течение двух минут, пока кончик иглы не окажется на два сантиметра выше кожи головы. Затем поверните стереотаксическую руку инжектора в сторону от операционного поля и закройте кожу головы монофиламентным швом 6-O. Для МРТ выполните взвешенную визуализацию T2, выбрав взвешенную T2 быструю спиновую эхо-последовательность.

После установки параметров МРТ, как описано в тексте, нажмите кнопку продолжить, чтобы запустить последовательность. Для обработки изображений и анализа объема мозга откройте собственные взвешенные данные T2 в программном обеспечении сегментации. Чтобы вручную очертить боковые желудочки, нажмите на режим кисти и выберите квадратный стиль кисти, затем отрегулируйте размер кисти до единицы.

Затем щелкните инспектор макета, выберите осевой вид и нажмите кнопку «Масштабировать по размеру». Затем наведите курсор на изображение и проследите и заполните боковое пространство желудочка. Наконец, нажмите на сегментацию на панели инструментов, а затем объем и статистику, чтобы просмотреть сегментированные тома.

У животных, перенесших инъекцию гемоглобина, развилась умеренная вентрикуломегалия при оценке с помощью МРТ. Со значительно большими боковыми желудочками через 24 часа и 72 часа после инъекции гемоглобина, по сравнению с ACSF, введенными животными. Хотя разница в объеме боковых желудочков между двумя группами крыс не была значительной через 38 дней, МРТ-сканирование показало, что 44% крыс, получавших гемоглобин, все еще имели неразрешенную вентрикуломегалию.

Более того, по сравнению с ACSF, инъекция гемоглобина привела к значительному уменьшению объема белого вещества через 38 дней. Гемоглобин также способствовал воспалительной реакции in vivo, о чем свидетельствует значительно более высокий уровень провоспалительного фактора некроза опухоли цитокина альфа после инъекции гемоглобина, но не физиологического раствора или цельной крови. Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание глиального фибриллярного кислого белка выявило значительно более высокую активацию астроцитов после инъекции гемоглобина, чем после инъекции ACSF.

Самое главное, что нужно помнить при попытке этой процедуры, это установить правильные координаты инъекции, чтобы обеспечить доставку гемоглобина в боковые желудочки. Следуя этой процедуре, индикаторы CSF могут быть доставлены в пространство CSF для оценки изменений в циркуляции CSF и моделей эффлюкса после IVH. Этот дополнительный метод рассматривает, как поток CSF изменяется в IVH PHH.