Метод количественного фракционирования микротрубочек для разделения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях мышей
17 ноября 2023 г.
Микротрубочки, которые являются полимерами тубулина, играют решающую роль в качестве компонента цитоскелета в эукариотических клетках и известны своей динамической нестабильностью. В этом исследовании был разработан метод фракционирования микротрубочек для разделения их на стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободный тубулин для оценки стабильности микротрубочек в различных тканях мышей.
Наш новый протокол помогает различать и количественно оценивать три статуса трубчатых колец, таких как стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободные канальцы в тканях животных. Этот метод состоит из простых шагов и позволяет оценить структурную стабильность трубок, которая не может быть обнаружена путем количественной оценки трубок после трансляционной модификации. Этот метод имеет важное значение для исследования и разработки терапевтических способов лечения заболеваний, где стабильность микротрубочек имеет решающее значение, таких как болезнь Альцгеймера и рак.
Начните процедуру с подготовки лабораторного белья к рассечению тканей. Наполните коробку колотым льдом и поставьте на нее две чашки Петри. Наполните одну посуду ледяным раствором фосфатного буфера или ПБС для кратковременного мытья и хранения рассеченных тканей.
На вторую посуду постелите фильтровальную бумагу, смоченную ПБС. Затем взвесьте 1,5-миллилитровые микропробирки, заполненные PBS, для хранения рассеченных тканей. После извлечения тканей из усыпленной мыши переложите их в пробирки и повторно взвесьте каждую микропробирку.
Переместите ткани в стеклянный гомогенизатор с ледяным стабилизирующим буфером из микротрубочек или MSB + среда и немедленно гомогенизируйте ткань с помощью охлажденного гомогенизатора. Теперь переложите гомогенат ткани в двухмиллилитровую микропробирку с помощью пипетки Пастера и центрифуги при 2,400 G в течение трех минут при двух градусах Цельсия. Перелейте надосадочную жидкость в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра для удаления мусора.
Вбейте надосадочную жидкость или фракцию S1 в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Сразу же пипетку 200 микролитров фракции S1 переложить в центрифугаторную микропробирку и центрифугировать при 100 000 G с помощью ротора TLA-55 в течение 20 минут при температуре два градуса Цельсия. После второго центрифугирования отделите надосадочную жидкость S2 от осадка P2.
Сразу же переложите все количество фракции S2 в центрифугируемую микропробирку и с помощью ротора TLA-120.2 открутите ее при 500 000 G в течение 60 минут при температуре два градуса Цельсия. После третьего центрифугирования отделите надосадочную жидкость S3 от осадка P3. Растворите всю фракцию S3 в 200 микролитрах 2X додецилсульфата натрия или буфера для образцов SDS.
Смешайте оставшиеся фракции S1 с равным объемом 2X буфера для образцов SDS для использования в качестве стандартной кривой для вестерн-блоттинга. Затем добавьте 400 микролитров буфера для образцов SDS в пробирки с фракциями P2 и P3. Затем кратковременно обработайте раствор ультразвуком, чтобы растворить осадок, прежде чем переложить образцы в новые 1,5-миллилитровые микропробирки и поместить их в холодильник.
Прокипятите все образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение трех минут. Микротрубочки во фракции P2 составляли 34,86% от общего количества альфа-тубулина в мозге мыши, в то время как микротрубочки во фракциях P3 и S3 составляли 56,13% и 9,01% соответственно. Процентное содержание бета-3 тубулина во фракциях Р2, Р3 и С3 достоверно не отличалось от содержания альфа-тубулина.
Фракция S2 показала ограниченное прохождение тубулина через ультрафильтрационную спиновую колонку мощностью 300 килодальтон, в то время как фракция S3 позволила полностью пройти тубулиновые комплексы. Хроматографическое разделение привело к 100-килодальтонному элюированию тубулина S3. В каждой фракции были обнаружены равные пропорции альфа- и бета-тубулина.
Фракции Р2 были значительно обогащены ацетилированным альфа-тубулином, в то время как тирозинированный альфа-тубулин доминировал во фракции Р3. Замораживание мозга перед гомогенизацией приводило к снижению концентрации альфа-тубулина во фракциях Р2. Однако альфа-тубулин увеличился во фракции Р3.
Замораживание также снижало уровень ацетилирования и повышало уровень тирозинизации альфа-тубулина во фракции Р2. Лечение нокодазолом снижало уровень альфа-тубулина во фракции Р2. В отличие от замораживания, нокодазол не влиял на посттрансляционные модификации Р2-тубулина.
В ткани головного мозга наблюдалась значительно более высокая концентрация Р2-тубулинов, тогда как Р3-тубулины были сконцентрированы в пролиферативной ткани. Вестерн-блоттинг показал, что Р2-тубулин, специфически обнаруженный в нервной системе, происходит из стабильных микротрубочек, а Р3-тубулин происходит из лабильных микротрубочек. Стабильность микротрубочек очень динамична.
Важно выполнить этот протокол быстро, без перерывов, в условиях низких температур. Также убедитесь, что ткани и фракции не были заморожены до растворения в буфере для образцов SDS. Ожидается, что сочетание иммунной презентации с использованием каждой фракции с протеомикой позволит выявить факторы, участвующие в динамике микротрубочек.
С помощью этого метода мы выявили, как нормальный тау существует на микротрубочках. Он также может быть использован для изучения того, как он становится ненормальным в старом мозге, чтобы идентифицировать новые лекарственные мишени деменции.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый протокол для дифференциации и количественного определения стабильных микротрубочек, лабильных микротрубочек и свободного тубулина в тканях животных. Метод позволяет оценить структурную стабильность микротрубочек, что имеет решающее значение для понимания таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и рак.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Динамика микротрубочек
Теоретические сведения
- Микротрубочки являются важными компонентами цитоскелета эукариотических клеток.
- Они проявляют динамическую нестабильность, что влияет на клеточные функции.
- Понимание стабильности микротрубочек имеет решающее значение для разработки методов терапии.
- Такие заболевания, как болезнь Альцгеймера и некоторые виды рака, связаны с дисфункцией микротрубочек.
Цель исследования
- Разработать метод фракционирования микротрубочек в тканях мыши.
- Оценить стабильность различных состояний микротрубочек.
- Углубить понимание заболеваний, связанных с микротрубочками.
Используемые методы
- Подготовка лабораторной одежды для диссекции тканей.
- Использование ледяного фосфатного буферного раствора при работе с тканями.
- Фракционирование микротрубочек на стабильный, лабильный и свободный тубулин.
- Количественное определение стабильности микротрубочек с помощью нового протокола.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет эффективно различать стабильные и лабильные микротрубочки.
- Количественный анализ позволяет получить представление о стабильности микротрубочек в различных тканях.
- Метод прост и воспроизводим для использования в лабораторных условиях.
- Полученные результаты способствуют пониманию динамики микротрубочек при различных патологиях.
Выводы
- Данный новый протокол является ценным инструментом для исследователей, изучающих стабильность микротрубочек.
- Он имеет потенциальное применение в понимании и лечении заболеваний, связанных с дисфункцией микротрубочек.
- Дальнейшие исследования могут опираться на эти результаты для изучения терапевтических путей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точная оценка стабильности микротрубочек имеет важное значение для анализа терапевтических механизмов при нейродегенеративных заболеваниях и раке, где динамика цитоскелета влияет на ответ на лекарственные препараты. Данный метод фракционирования позволяет проводить прямое количественное определение пулов стабильного, лабильного и свободного тубулина в нативных тканях, обеспечивая биохимический анализ, дополняющий методы визуализации и анализы на специфические модификации. Разрешая функциональные состояния микротрубочек, данный метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в программах раннего поиска агентов, модулирующих микротрубочки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтическую гипотезу путем количественного определения сдвигов в популяциях стабильных и лабильных микротрубочек в ответ на воздействие соединения.
- Практическая ценность: предоставляет биохимический анализ на основе тканей для подтверждения связывания мишени агентами, стабилизирующими или дестабилизирующими микротрубочки.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов путем корреляции биохимической стабилизации микротрубочек с функциональными результатами в системах, релевантных для данного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать количественные данные фракционирования тубулина, подходящие для высокопроизводительного скрининга библиотек соединений, влияющих на динамику микротрубочек.
- Воспроизводимость: использование стандартизированных этапов ультрацентрифугирования обеспечивает стабильное разделение фракций микротрубочек в разных экспериментах.
- Масштабируемость: совместимость с вестерн-блоттингом и протеомным анализом для идентификации регуляторов стабильности микротрубочек во фракционированных пулах тубулина.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: позволяет выявлять тканеспецифические вариации стабильности микротрубочек, которые коррелируют с пролиферативной способностью, что обеспечивает стратификацию доклинических моделей.
- Трансляционная преемственность: связывает биохимические состояния микротрубочек с признаками посттрансляционных модификаций (например, ацетилированием в стабильных и тирозинированием в лабильных пулах) для согласования биомаркеров.
- Прогресс с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя количественные показатели стабильности, которые позволяют прогнозировать терапевтический индекс в программах, направленных на воздействие на микротрубочки.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации свинцовых соединений, где стабильность микротрубочек служит фармакодинамическим биомаркером для подтверждения механизма действия.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез путем измерения вызванных соединениями сдвигов в состояниях полимеризации микротрубочек в лизатах нативных тканей.
- Скрининг: Позволяет стандартизировать анализ с помощью определенных порогов седиментации (100,000 × g для стабильных, 500,000 × g для лабильных микротрубочек) для обеспечения воспроизводимого фракционирования.
- Аналитика: Обеспечивает количественное определение тубулина с помощью вестерн-блоттинга фракций P2 (стабильный), P3 (лабильный) и S3 (свободный тубулин) для сравнения эффектов соединений.
- Трансляционные исследования: Сопоставляет данные фракционирования микротрубочек с паттернами тканеспецифичной экспрессии и профилями модификаций для доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую биохимическую платформу для оценки соединений, нацеленных на микротрубочки, при различных заболеваниях и типах тканей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет прямого измерения состояний полимеризации микротрубочек, а не только за счет анализа посттрансляционных модификаций.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным параметрам центрифугирования и обработке при контролируемой температуре для сохранения целостности микротрубочек.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность при принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), обеспечивая ортогональную валидацию механизма воздействия на микротрубочки помимо клеточных анализов.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе количественной эффективности стабилизации в тканях, имеющих значение для данной патологии.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области гомогенизации тканей и методах ультрацентрифугирования для поддержания стабильности микротрубочек в процессе обработки.
- Зависимость от доступа к высокоскоростным роторам (TLA-55 и TLA-120.2), способным развивать ускорение 100,000 × g и 500,000 × g для разделения фракций.
- Необходима межлабораторная стандартизация времени и температуры фракционирования для обеспечения воспроизводимости результатов в разных лабораториях.
- Требуется адаптация состава буфера и параметров центрифугирования при применении метода к ненервным тканям с иной плотностью микротрубочек.
- Ограничение, связанное с необходимостью незамедлительной обработки образцов для предотвращения артефактной деполимеризации микротрубочек во время работы с материалом.
