Пошаговый метод обнаружения нейтрализующих антител против AAV с использованием колориметрического клеточного анализа

Ранее существовавшие антитела, которые нейтрализуют AAV, представляют собой барьер для продвижения генной терапии AAV. Этот анализ является инструментом скрининга для выявления нейтрализующих антител против AAV. Основным преимуществом является то, что он экономичен, экономит время, прост в настройке и требует минимальных технических навыков, лабораторного оборудования и реагентов.

Начните покрывать клетки HT1080 в первый день, разбавляя клетки до концентрации от 1 х 10 до пятой клетки на миллилитр в предварительно нагретой полной среде DMEM. Затем посейте 100 микролитров клеток на лунку в прозрачные 96-луночные плоскодонные пластины до концентрации 1 х 10 до четвертой ячейки на лунку. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислым газом в течение 16-22 часов.

На второй день генерируйте серийные разведения интересующих образцов сыворотки в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных трубках с использованием предварительно нагретого полного DMEM. К каждой пробирке с разбавленными образцами сыворотки добавляют 66 микролитров 7,5x10 к шести вирусным геномам на микролитр рабочего раствора вируса. Смешайте разбавление сыворотки вируса путем пипетирования, а затем поместите пробирки, содержащие смеси сыворотки вируса, в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 30 минут, чтобы обеспечить потенциальную нейтрализацию.

Через 30 минут пипетку 100 микролитров смеси сыворотки вируса в каждую лунку на 96-луночной пластине, содержащей 1x10 до четвертой клетки на лунку, затем обернули пластину в фольгу для размещения в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа на ночь на 16-24 часа. На третий день аспирируйте среду из скважин 96-луночной пластины с использованием вакуума дымовой вытяжки, не нарушая прилипшие ячейки, и добавьте 50 микролитров 4% параформальдегида в каждую скважину. Завернув тарелку в фольгу, оставьте ее на 10 минут при комнатной температуре.

Позже промыть и аспирировать клетки дважды 200 микролитрами PBS при комнатной температуре. После второй промывки пипетку 200 микролитров предварительно нагретого ПБС в каждую лунку и заворачивают пластину в фольгу с последующей инкубацией при 65 градусах Цельсия в течение 90 минут для денатурации эндогенной щелочной активности фосфатазы после инкубации на 50 микролитрах свежеприготовленного растворенного BCIP/NBT в каждую лунку и инкубируют обернутые пластины при комнатной температуре в течение двух-24 часов. Позже сделайте фотографии каждой скважины с помощью объектива 4X в камере светового микроскопа, обеспечив последовательное использование одной и той же экспозиции, балансировки белого и настроек освещения для всех анализов.

Чтобы проанализировать изображение в ImageJ, выберите файл и нажмите кнопку Открыть. Для цветных изображений преобразуйте их в шкалу серого, выбрав вкладки Изображение, Тип и 8-битные вкладки по порядку. Затем перейдите на вкладку «Изображение» и выберите «Настроить» и «Порог», чтобы изменить пороговое значение, пока все цветные области не станут окрашенными и красными, а фон — нет.

нажмите «Анализировать и устанавливать измерения» и установите флажки «Площадь», «Доля площади», «Предел порога» и «Отображать метку», прежде чем нажать OK.To определить показания сигнала данной скважины, нажмите «Анализировать и измерять», чтобы в столбце процентной площади всплывающего окна отображалось показание сигнала. Исследование установило оптимальную дозу вируса путем добавления гена-репортера AAV6-hPLAP в клетки в диапазоне концентраций вирусного генома. Кратность инфекции 15 000 придавала 36% окраски пластин и была выбрана в качестве оптимальной вирусной дозы.

Репрезентативный анализ отображает корреляцию между окраской и множественностью инфекции. Получена самая высокая испытанная концентрация, которая не влияла на линейную корреляцию между окраской и вирусной концентрацией. Исследование нейтрализующей активности на анти-AAV6 моноклональном антителе против аденоассоциированного вируса или AAV6 в разведении log 10 показало 50%-ное ингибирование трансдукции AAV6 или TI50 в концентрации 10 нанограмм на миллилитр.

В анализе нейтрализующих антител или NAb степень нейтрализации AAV варьировалась в пределах наивной выборочной популяции со значениями титра TI50 в диапазоне от 1/2 до 1/80. Результаты анализа показали, что значения титра AAV ингибирования TI50 до введения AAV варьировались от 1/4 до 1/80. После введения AAV титр TI50 увеличился до 1/2000 и более 1/32 000, демонстрируя четкий контраст в значениях титра между введением до и после AAV.

При фотографировании скважин важно последовательно использовать одни и те же настройки микроскопа на протяжении всего анализа, а также убедиться, что фотографии сделаны непосредственно в центре скважин.