Высокопроизводительный анализ нефотохимического закалки сельскохозяйственных культур с использованием флуорометрии с импульсно-амплитудной модуляцией хлорофилла

Этот метод может дать представление о генетических вариациях в нефотохимическом гашении, доступном в панелях генетического разнообразия или размножающихся популяциях. Основным преимуществом этого метода является возможность скрининга большого количества генотипов на вариации нефотохимического закалки в течение одного дня. Протокол представлен для глицина макса или сои, но может быть адаптирован для анализа других растительных пространств, из которых могут быть собраны подъемные диски.

Для тех, кто выполняет протокол в первый раз, ключом является обращение с подъемным диском, чтобы предотвратить повреждение или перенасыщение губок водой. Для начала проведите отбор проб растений на полевом участке через 30 дней после прорастания. Заполните 1/3 уровня дистиллированной воды во всех колодцах плиты из 24 скважин.

Пометьте крышку и боковую часть пластины репликами для отбора проб. Держите самый молодой полностью расширенный лист, присутствующий в верхней части растения, против резиновой пробки. Вдавите пробковый бур Гумбольдта номер два через лист и скрутите, чтобы разрезать диск, избегая среднего ребра.

Последовательно собирайте пять дисков с одного листа для технических реплик. Вытолкните листовые диски из пробкового бура в один колодец из 24-луночной пластины с помощью ватного тампона и повторите это для другого растения того же генотипа. Убедитесь, что все листовые диски плавают в воде.

Если нет, осторожно переместите листовые диски, прилипшие к боковой части колодца, в плавающее положение ватным тампоном. Переходим к дисковым образцам из следующего графика. Поместите крышку и уплотнение полупрозрачной гибкой пленкой.

после завершения отбора проб во всей 24-луночной плите. Храните тарелку подальше от прямых солнечных лучей в пакете, коробке или пустом кулере. В чистом лабораторном помещении постучите по крышке герметичной пластины, чтобы выбить листовые диски, прилипшие к крышке во время транспортировки.

Распакуйте пленку и снимите крышку. Перенесите листовой диск из первого положения 24-луночной плиты в свежую 96-луночную пластину с листовым диском, обращенным плоско вниз на дне колодца. Разрежьте фильтр аспиратора для носа пополам.

Опустите полученный фильтр наполовину в воду и нанесите на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Вставьте фильтр в колодец с помощью листового диска для поддержания влажности. Возьмите второй листовой диск из первого положения 24-луночной плиты и поместите его лицевой стороной вниз в следующее доступное положение плиты из 96 скважин.

Опустите оставшуюся половину произведенного назального фильтра в воду и смажьте его на бумажное полотенце, прежде чем вставить его в колодец со вторым листовым диском. Заклейте верхний правый угол, чтобы сориентировать пластину в темноте для визуализации. Запечатайте пластины полупрозрачной гибкой пленкой и оберните пластину в алюминиевую фольгу.

Напишите идентификаторы участков и идентификатор пластины на алюминиевой фольге. Поместите пластины в темную коробку или шкаф минимум на 30 минут для расслабления первых двух фаз нефотохимического закалки. Используйте длительный темный инкубационный период за один час до визуализации, если представляют интерес долгосрочные фазы нефотохимического закалки.

Подготовьте дополнительную фиктивную пластину для фокусировки во время анализа, поместив листовой диск в каждый угол свежей 96-луночной пластины и один в центре. Закрепите листовые диски с помощью носовых фильтров, как это было сделано с предыдущими пластинами, запечатайте пластину и инкубируйте в темноте при комнатной температуре и относительной влажности 50%. Включите тепловизор и откройте программное обеспечение для создания образов.

Нажмите «Настройки», а затем «Протокол», чтобы открыть окно для ввода шагов в экспериментальном протоколе PAM. Установить технические характеристики машины, приведенные в рукописи. Настройте программу на запуск с насыщенного импульса для измерения максимальной квантовой эффективности адаптированного к темноте фотосинтеза, введя 20 секунд в поле с именем After a delay of.

Щелкните поле Применить импульс и введите 1 в поле Под названием Это количество раз. Установите для импульса PPFD значение 6 152, длину импульса до 800 миллисекунд и установите флажок Принимать F простые и FM-изображения со всеми импульсами. Установите флажок Вставить после, чтобы добавить второй шаг в протокол.

Введите 30 секунд в поле После задержки. Затем выберите опцию Изменить актиническую и введите 50 в поле под названием Actinic PPFD, чтобы установить интенсивность света в камере на уровне 50 PPFD. Нажмите кнопку Вставить после, чтобы добавить новый шаг в протокол, и введите 150 секунд в поле После задержки.

Выберите Применить импульс и введите 4 в поле Под названием Это количество раз, чтобы применять измерительные импульсы каждые 150 секунд четыре раза подряд, в то время как актинический свет удерживается при 50 PPFD. Отрегулируйте задержку и интенсивность света для каждого шага в соответствии со значениями, указанными в рукописи, прежде чем сохранять протокол в виде файла pcl в нужном месте. Выключите свет и поместите фиктивную пластину лицевой стороной вниз на стадию образца так, чтобы адаксиальная поверхность листа указывала вверх к детектору, а губка была обращена вниз к платформе.

Установите высоту ступени образца таким образом, чтобы листовые диски находились на 140 миллиметров выше основания инструмента. Щелкните значок подключения/отключения от фотокамеры и аппаратной камеры, чтобы запустить камеру. Щелкните символ флуоресценции фокусировки, представленный красным двусторонним значком стрелки с двумя зелеными линиями в основании, и отрегулируйте объектив и экспозицию, чтобы сфокусировать пластину.

Щелкните значок флуоресценции фокусировки еще раз, чтобы выключить мигающий индикатор. Работая в темноте, замените фиктивную пластину на анализируемую пластину. Поместите его лицевой стороной вниз с лентой снаружи, используемой для ориентации в правом верхнем углу, и нажмите значок камеры с изображением карты.

Отрегулируйте экспозицию изображения, открыв или закрыв диафрагму, пока панель во всплывающем окне не будет расположена в зеленой зоне. Нажимайте кнопку Try Again после каждой регулировки диафрагмы до тех пор, пока экспозиция не будет правильно отрегулирована и инструмент не получит изображение. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Применить изоляцию изображения, чтобы заблокировать фоновые сигналы.

Сфокусированная область листа будет отображаться серым цветом, а фон — синим. Выберите интересующую область или пикселы, чтобы включить только листовые диски, отрегулировав гистограмму и уровень гаммы в раскрывающемся меню «Изменить изображение», щелкнув правой кнопкой мыши изображение. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Удалить высокие и низкие разрезы, чтобы удалить светло-синие выделенные области.

Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Удалить отклонения, чтобы удалить все пиксели, не затрагивающие последние три других пикселя. Любые области на изображении, которые выглядят как изолированные острова, будут проанализированы отдельно и включены в окончательный вывод данных. Щелкните значок запуска протокола, чтобы запустить программу.

В нижней части экрана появится таймер, сообщающий вам, сколько времени осталось для запуска протокола. Дождитесь завершения работы с протоколом. Щелкните Файл и Сохранить как, чтобы сохранить данные в виде файла igr.

Закройте окно, нажав на красный крестик в правом верхнем углу окна, прежде чем запускать другую табличку с образцами. Чтобы экспортировать данные флуоресценции хлорофилла, откройте файл igr в программном обеспечении для обработки изображений и нажмите «Файл», а затем «Экспорт в папку», чтобы создать новую папку со всеми необходимыми файлами. Типичное измерение нефотохимического закалки в выращенных в полевых условиях соевых бобов показало, что после первоначальной насыщенной вспышки для определения Fv / Fm, когда листовые диски подвергались воздействию слабого света 50 микромолей на метр в секунду, нефотохимическое закалка было менее одного.

Кроме того, при переходе на высокий свет 2000 микромолей в метр в секунду нефотохимическое закалка увеличивалось до максимального значения четырех через 15 минут. Неудачное измерение показало минимальное увеличение нефотохимического закалки при переходе на высокий свет. Ориентировочные пластины внутри тепловизора и четко определенный план отбора проб и покрытия листовых дисков имеют важное значение для обеспечения того, чтобы данные были связаны с правильным генотипом.

Этот протокол может количественно оценить влияние экологических переменных, таких как засуха и линька, на нефотохимическое закалку или оценить нефотохимическое закалку на различных уровнях полога для уточнения моделей сельскохозяйственных культур.