Изучение биомолекулярного взаимодействия между молекулярным шапероном Hsp90 и его клиентской протеинкиназой Cdc37 с использованием технологии полевого биозондирования

FEB - это платформа обнаружения взаимодействия без меток и экономичная ____ ____________________________________________________ Этот метод предлагает валидацию известных или неизвестных взаимодействий и простой способ тестирования потенциальных ингибиторов биомолекулярных взаимодействий. Основным преимуществом FEB является его автоматизированное, удобное программное обеспечение, которое охватывает пользователя на протяжении всего эксперимента с открытой платформой ручного пипетирования, позволяя пользователям работать с небольшим обучением или даже без него.

Технология FEB также предлагает применение в различных областях фармацевтики, биомолекулярного анализа малых молекул, пептидов и белков, валидации лекарств путем перевода биологической активности in vitro в эффективность in vivo. Будучи новичком, вы можете столкнуться с проблемами в выборе правильных концентраций анализируемых веществ для оптимизации эксперимента, чтобы получить надежное значение KD. Мы советуем уделить внимание процессу функционализации чипа и правильному буферному обмену.

Начните с смешивания равных объемов раствора EDC и сульфо-NHS путем пипетки вверх и вниз. Поместите чип биосенсора, поставляемого компанией, в стеклянную чашку Петри с установленной крышкой. Все этапы функционализации, связанные с активацией чипа, предлагается выполнять в чашке Петри.

Нанесите 50 микролитров одномолярного MES-буфера на чип биосенсора. Инкубировать в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем аспирируйте буфер и нанесите 50 микролитров раствора EDC sulfo-NHS немедленно на чип датчика.

Накройте чашку Петри крышкой и высиживайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Аспирируйте раствор EDC sulfo-NHS из чипа и нанесите 50 микролитров одномолярного буфера MES. Аспирируйте буфер MES и дважды промойте чип 50 микролитрами 1X PBS.

Аспирируйте PBS из чипа и добавьте молекулу-мишень Hsp90. Накройте стеклянную чашку Петри и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем аспирируют раствор, содержащий молекулу-мишень, и смывают три раза 50 микролитрами 1X PBS.

Аспирируйте раствор 1X PBS из чипа и добавьте 50 микролитров гашения одного раствора. Накройте стеклянную чашку Петри и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Аспирируйте гашение одним раствором из чипа и добавьте 50 микролитров закалки двумя растворами.

Накройте стеклянную чашку Петри и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого аспирировать гашение двух растворов из чипа и промыть чип пять раз, используя 50 микролитров 1X PBS, оставив последнюю каплю PBS на датчике. Подготовьте серию разбавления анализируемого вещества для Cdc37 в желаемом диапазоне концентраций.

Спроектируйте эксперимент таким образом, чтобы включить по меньшей мере восемь различных концентраций анализируемого вещества для получения надежной константы диссоциации, или значения KD, и подготовьте эти различные разведения в том же буфере, который используется для калибровки и целевого белка. Аккуратно поместите чип к инструменту. Убедитесь, что программное обеспечение включено, а светодиодный индикатор загорается зеленым.

Затем нажмите модуль Run Experiment на автоматизированном программном обеспечении и выберите 10 точек с регенерацией или любым другим нужным протоколом. Заполните такие сведения, как имя оператора, название эксперимента, дата, буфер регенерации, иммобилизованная мишень и анализируемый элемент в растворе. Нажмите кнопку Начать эксперимент, отображаемую в программном обеспечении, и следуйте инструкциям, отображаемым автоматическим программным обеспечением.

Для выполнения калибровки прибора аспирируйте оставшийся раствор PBS из микросхемы и примените 50 микролитров калибровочного буфера. Нажмите кнопку Продолжить и подождите пять минут, пока шаг калибровки не будет завершен. Программное обеспечение отображает конечную точку, определенную для этапа калибровки, с предупреждающим сигналом для последующих действий.

Затем выполните ассоциацию анализируемого вещества, аспирируя калибровочный буфер из чипа и применяя 50 микролитров самой низкой концентрации анализируемого вещества. Нажмите кнопку Продолжить и подождите пять минут, пока шаг ассоциации не будет завершен. Программное обеспечение отображает конечную точку для шага связи с предупреждающим сигналом.

Чтобы выполнить диссоциацию анализируемого вещества, аспирируют раствор анализируемого вещества из чипа и применяют 50 микролитров буфера диссоциации. Нажмите кнопку продолжить. После длительности шага диссоциации программное обеспечение отображает конечную точку для шага диссоциации с предупреждающим сигналом.

Затем выполните регенерацию чипа, аспирируя диссоциационный раствор от чипа и применяя 50 микролитров буфера регенерации. Затем нажмите кнопку Продолжить. Этап регенерации обычно занимает около 30 секунд.

После этого программное обеспечение отображает конечную точку для шага регенерации с предупреждающим сигналом для последующих действий. Наконец, чтобы промыть чип, аспирируйте раствор регенерации из чипа и нанесите 50 микролитров буфера промывки. Аспирируйте раствор из чипа и повторите это пять раз.

Оставьте последнюю каплю буфера для стирки на чипе. Затем нажмите кнопку Продолжить и подождите 30 секунд, пока длительность шага стирки не будет завершена на дисплее программного обеспечения. Повторите шаги для каждой используемой концентрации анализируемого вещества.

Пять этапов калибровки, ассоциации анализируемого вещества, диссоциации, регенерации и промывки пять раз составляют один цикл. Нажмите кнопку «Анализ» в программном обеспечении автоматизированного анализа в конце эксперимента. Появится окно отображения, содержащее все экспериментальные точки.

Убедитесь, что концентрации анализируемого вещества, используемые для предписанного протокола, являются правильными. Нажмите кнопку Выполнить анализ, чтобы автоматически сгенерировать значение KD. Программное обеспечение генерирует график соответствия холма, строя концентрации анализируемого вещества против соответствующих I-ответов, из которых вычисляется константа диссоциации в равновесии.

Целевой белок Hsp90 иммобилизовали в чип, и для первого эксперимента было приготовлено 10 концентраций анализируемого белка Cdc37 в диапазоне от 25 наномоляров до 5000 наномоляров. Здесь показаны файлы данных, сгенерированные из первого эксперимента. Экспериментальные данные, отслеживаемые в режиме реального времени, показаны здесь.

Ось Y соответствует I-отклику в блоках биосенсора, а ось X соответствует различным временным точкам и концентрациям анализируемого вещества в эксперименте. Графическое изображение, показанное здесь, представляет собой график соответствия холма, сгенерированный с помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения. Ось Y соответствует I-отклику в биосенсорных блоках, а ось X соответствует различным концентрациям анализируемого вещества в эксперименте.

Графическое изображение, показанное здесь, представляет собой ассоциативный график, сгенерированный с помощью программного обеспечения статистического анализа. Ось Y соответствует I-отклику в конце ассоциативной фазы, а ось X соответствует различным концентрациям анализируемого cdc37. Во втором эксперименте использовался другой набор концентраций в диапазоне от 0,4 наномоляра до 200 наномоляров, и здесь показаны сгенерированные файлы данных.

Графические изображения представляют термограмму ITC взаимодействия Hsp90 и Cdc37. Здесь показаны соответствующие тепловыделяющие кривые, полученные в результате последовательных инъекций Cdc37 в Hsp90 при 298,15 Кельвина. Дифференциальная мощность, используемая здесь, является функцией времени.

Интегрированные точки данных на этом графике обозначают соответствующую нормализованную теплоту по сравнению с отношением Мюллера Hsp90 к Cdc37. Открытый подход к пипетированию, используемый здесь, требует, чтобы пользователь обладал базовым мастерством ручной пипетки, следя за тем, чтобы не прикасаться к биосенсору наконечником. Воспроизводимость времени шага полностью зависит от пользователя.

Как только исследователь охарактеризует взаимодействие между двумя биомолекулами, мы можем выполнить скрининговый эксперимент, разработав потенциальные ингибиторы или модуляторы, нацеленные на конкретное биомолекулярное взаимодействие с использованием системы FEB. Эта процедура может быть использована для идентификации, проверки и количественной оценки известного и нового взаимодействия между белками, а также небольшими молекулами, включая лекарства и пептиды.