Интервью: Презентация гликолипид антигена CD1d и терапевтический потенциал активации ячейки NKT

Здравствуйте, меня зовут Митчелл Кроненберг, я работаю в Институте аллергии и иммунологии Ла-Хойя. Я являюсь президентом и научным руководителем, но при этом возглавляю очень активную исследовательскую лабораторию, и сегодня мы будем говорить об одной из имеющихся у нас технологий — тетрамерах CD 1D. Большая часть работ в моей лаборатории посвящена CD 1D-реактивным T-клеткам.

Эти клетки уникальны тем, что они распознают гликолипиды, а не пептиды. Другое направление работы моей лаборатории посвящено совершенно иной теме — слизистой иммунной системе и ее регуляции. Молекулы CD1 являются молекулами, представляющими антиген, а это означает, что они связывают антигены, фрагменты белков или другие молекулы и удерживают их для распознавания Т-клетками.

На самом деле существует два различных типа антигенпрезентирующих молекул. Одни удерживают или представляют пептиды, а другие — липиды и гликолипиды. Молекулы CD1 удерживают липиды и гликолипиды.

В этом заключается их функция: они удерживают и представляют эти липиды и гликолипиды T-клеткам. Существует четыре различных типа молекул CD1: CD1A, B, C и D. В частности, мы фокусируемся на CD1D, которая, вероятно, изучена лучше всего, отчасти благодаря наличию мышиных моделей. CD1D представляет гликолипиды определенному виду T-клеток, называемым естественными киллерными T-клетками — необычным видом лейкоцитов, обладающим признаками как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа.

Представленные гликолипиды могут быть собственными гликолипидами, хотя на данный момент они недостаточно охарактеризованы, или же микробными гликолипидами. Известно, что гликолипиды, которые подвергаются презентации, происходят из двух источников. Одним из них являются так называемые FMS-бактерии, которые, вероятно, являются наиболее распространенными бактериями в биосфере.

Они обитают в океане, в растениях, в почве. Однако они редко вызывают заболевания у людей. Полагаю, мы очень привыкли жить с этими бактериями.

Вторая известная нам категория — другой тип гликолипидов, называемых гликолипидами, содержащими диглицерол. Они встречаются у Borrelia burgdorferi, вызывающей болезнь Лайма, и, вероятно, у многих других патогенов. Сейчас мы только начинаем выяснять, какие еще виды бактерий обладают такими гликолипидами.

Таким образом, у нас есть так называемые гликосфинголипиды из SMS и диацилглицеролипиды из Borrelia, а также, вероятно, из многих других истинно патогенных организмов. Эти липиды загружаются на молекулы CD1D, преимущественно на дендритных клетках, хотя это могут быть также B-лимфоциты, клетки печени и, возможно, другие типы клеток. Эти молекулы CD1D проходят через лизосомы и эндосомы, где они, вероятно, связывают данные липиды, а затем выносят липид на поверхность клетки для распознавания T-клетками, включая естественные киллеры T-клеточного ряда (NKT-клетки), о которых я упоминал ранее.

Одним из последствий воздействия бактерий, содержащих гликолипиды, является очень быстрая активация NK T-клеток. Конвенциональные T-клетки, иными словами, пептид-реактивные T-клетки, обычно требуют трех или четырех дней для запуска полноценного иммунного ответа, особенно если они ранее не сталкивались с данным антигеном.

Другими словами, в таком состоянии они наивны. Напротив, NK T-клетки могут быть активированы в течение нескольких часов и начнут вырабатывать такие цитокины, как гамма-интерферон, что важно для элиминации бактерий за очень короткий промежуток времени. Таким образом, они напоминают определенные аспекты врожденного иммунного ответа.

Изучая модельные антигены, мы узнали, что CD 1D перемещается в поздние эндосомы и лизосомы — сильнокислые внутриклеточные компартменты, в которых гликолипидные антигены загружаются в CD 1D. В антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, фактически существуют специальные транспортные белки, которые помогают загружать липиды в молекулу CD 1D. В случае с бактериями рода *Francisella*, *Borrelia* и другими мы имеем дело с внеклеточными бактериями. Следовательно, липидные антигены должны каким-то образом транспортироваться внутрь клетки, вероятно, в лизосому, где они и загружаются в молекулу CD 1D.

Затем происходит немедленная активация NKT-клетки, и всё это должно произойти в течение нескольких часов в синусоидах печени, селезенки, возможно, в костном мозге и других местах, где обнаруживаются NKT-клетки. Тетрамерная структура имеет решающее значение для однозначного определения этих естественных киллеров Т-клеток, которые обладают врожденными свойствами, отличающими их от других Т-клеток. Другие доступные маркеры слишком неоднозначны, но тетрамеры позволяют идентифицировать клетки на основе специфичности их антигенного рецептора, что является ключевым фактом, определяющим их; создание тетрамеров началось довольно давно.

Этот метод был разработан Марком Дэвисом и Джоном Алманом; идея заключалась в том, что Т-клеточный рецептор обладает низким сродством, и если вы хотите определить или идентифицировать клетки на основе их специфичности, то пептидов, которые они распознают, или комплексов пептидов с молекулами, представляющими антиген, недостаточно по силе связывания (аффинности), чтобы позволить идентифицировать клетку. Поэтому Марк Дэвис и Джон Алман изобрели технологию тетрамеров — способ создания тетрамеров, а в некоторых случаях и октомеров, состоящих из молекулы, представляющей антиген, и представляемого ими антигена, что фактически увеличивает аффинность или силу взаимодействия. Таким образом, можно визуализировать клетку, специфичную к пептиду гриппа и конкретной молекуле, представляющей антиген, или к любому другому интересующему вас антигену.

Это очень важная технология, поскольку она позволяет, например, оценить эффективность режима вакцинации. Мы начали применять её в конце девяностых; изначально я опубликовал статью в 2000 году, которая к настоящему моменту была процитирована около 500 раз. Мы просто адаптировали эту технологию для работы с липидами.

Таким образом, мы получили растворимые молекулы CD1 и с помощью методов, которые я опишу чуть позже, смогли их мультимеризовать, иными словами, объединить их со специфическими гликолипидами. Это позволило нам использовать их в качестве реагентов для анализа специфических Т-клеточных рецепторов, а именно тех, которые распознают интересующий нас гликолипид в комплексе с CD1D. Такие тетрамеры можно использовать в любой ситуации, когда необходимо проанализировать количество NKT-клеток, состояние их активации и их функцию.

В нашей лаборатории это может быть частью любого из множества различных проектов. Например, если вы хотите выяснить, влияют ли определенный мутант и сигнальный путь на развитие NK T-клеток, мы можем сделать это с помощью наших тетрамеров, определив количество NKT-клеток. Кроме того, существуют другие маркеры, другие белки клеточной поверхности, которые мы можем изучить, чтобы оценить, являются ли NKT-клетки зрелыми или активированными. Используя тетрамеры после антигенной стимуляции, мы можем выяснить не только то, активированы ли они, но и какие цитокины они вырабатывают.

Таким образом, мы можем сочетать окрашивание тетрамерами, например, с внутриклеточным окрашиванием цитокинов и определить, какой процент NKT-клеток вырабатывает гамма-интерферон, какой процент вырабатывает IL-4, а какой — оба цитокина; с помощью многопараметрической проточной цитометрии мы можем ответить на различные вопросы о продукции цитокинов этими клетками непосредственно ex vivo. Мы также можем проводить дальнейшие эксперименты. Например, тетрамеры можно использовать для очистки NKT-клеток для культивирования in vitro, чтобы изучить их взаимодействие с другими типами клеток, или даже для переноса реципиенту, например, животному, у которого по генетическим причинам отсутствуют NKT-клетки.

Мы хотим восстановить эту функцию. Мы можем сделать это, а также изучить, где локализуются клетки и как они функционируют. Наконец, я знаю, что в случае с человеческими NKT-клетками исследователи фактически использовали тетрамеры для экспансии клеточных линий in vitro, чтобы наращивать популяцию клеток для аналитических и, потенциально, даже для терапевтических целей.

Для создания тетрамеров CD 1D мы используем систему экспрессии вируса Bao. Процесс начинается с общей ДНК-конструкции, содержащей промотор и последовательности для экспрессии β2-микроглобулина и тяжелой цепи CD 1D. Таким образом, молекула CD 1 представляет собой гетеродимер, состоящий из двух полипептидов.

Таким образом, мы используем систему экспрессии с двумя промоторами и заражаем клетки культур тканей насекомых вирусами vao, тщательно титрованными, как было объяснено в нашем канале. Затем мы заражаем клетки и собираем из среды для культивирования белок, экспрессируемый клетками. Тяжелая цепь CD 1D модифицирована специально для производства тетрамеров.

Есть две вещи, или, скорее, три вещи, которые мы делаем. Одна из них — удаление трансмембранного участка. Таким образом, мы экспрессируем растворимый белок.

Во-вторых, мы добавили гексагистидиновый тег (hexa-his tag), чтобы белок можно было очистить методом металло-аффинной хроматографии. И в-третьих, у нас есть так называемый сайт связывания биотина для ферментативного биотинилирования. В этом и заключается инновация.

Это было крайне важно, когда Дэвис и Алман впервые изобрели технологию производства тетрамеров. После выделения белка он очищается с помощью никелевой колоночной хроматографии. Иногда после этого мы проводим эксклюзионную хроматографию.

Затем белок можно подвергнуть ферментативному биотинилированию; после биотинилирования при инкубации с антителами к стрептавидину он будет образовывать тетрамеры. Растворимый белок CD1 можно инкубировать практически в течение всей ночи в растворе интересующего гликолипида. Очень важно, чтобы гликолипид не был растворен в DMSO, который обычно используется в качестве разбавителя или растворителя для гликолипидов, так как CD1 очень чувствителен к нему.

Обычно мы используем буфер, содержащий небольшое количество Tween и PBS. Этот буфер очень эффективен для растворения большинства наших гликолипидов. Для загрузки в CD 1D, которая, по-видимому, происходит спонтанно, мы используем стрептавидин от одного из различных производителей.

И при конъюгации с PE, fico, eryn или красителем PC-фикоцианином — любым из них — результат оказывается очень хорошим и обеспечивает качественное окрашивание. Таким образом, в целом процедура не слишком отличается от хорошо изученных методов создания тетрамеров MHC I класса, за исключением того, что мы не используем бактериальную экспрессию, а применяем бактериально-вирусную экспрессию, и, разумеется, используем липидные антигены вместо пептидов. Один момент, который следует подчеркнуть: у людей также есть NKT-клетки, и они обладают той же специфичностью, что и NKT-клетки мышей.

Таким образом, специфичность сохраняется на протяжении как минимум 60 миллионов лет с тех пор, как мы разошлись с грызунами; фактически, мы создаем тетрамеры человеческого CD 1D теми же методами, которые вы можете видеть в данном видео. На самом деле, человеческие NK T-клетки очень хорошо взаимодействуют с мышиными тетрамерами, и наоборот. Поэтому мы не так часто изготавливаем человеческие тетрамеры, поскольку для работы с человеческим материалом можем использовать наши мышиные тетрамеры.

Существует множество моделей на мышах, в которых было показано, что NK T-клетки являются критическими детерминантами исхода иммунного ответа. Этот спектр охватывает ответы на раковые заболевания, регуляцию аутоиммунных заболеваний, элиминацию инфекционных агентов и даже развитие склеротических бляшек. Последнее представляет собой хронический воспалительный процесс, развивающийся в артериях.

Существуют определенные вопросы относительно значимости этих клеток у людей, где они встречаются реже. Было опубликовано множество сообщений, указывающих на то, что они изменяются при аутоиммунных состояниях, а также есть данные об их высокой концентрации в легких пациентов с астмой. Хотя эти данные представлены в одном из отчетов в New England Journal of Medicine, этот вопрос вызывает некоторые споры. Тем не менее, ряд исследований на людях позволяет предположить, что эти клетки могут играть важную роль.

Что касается клинических исследований, стимуляция NKT-клеток была протестирована в четырех фазах первой фазы испытаний для пациентов с запущенными стадиями рака. Имеются некоторые данные об эффективности, хотя, разумеется, эти пациенты находятся в тяжелом состоянии; исследования продолжаются при нескольких различных типах рака. Также есть специалисты, заинтересованные в применении медикаментозной терапии NKT-клетками при аутоиммунных заболеваниях, хотя эта работа пока не получила широкого развития.

Тетрамеры могут играть важную роль в этих исследованиях, прежде всего, для анализа состояния NKT-клеток после терапии агонистами. Как правило, идея заключается в использовании гликолипидных агонистов или, в некоторых случаях, даже гликолипидных антагонистов, которые разрабатываются другими группами, в зависимости от ответа и состояния пациента. Затем, с помощью тетрамеров, проводится стандартная оценка того, что произошло с NKT-клетками.

Другим потенциальным применением может быть экспансия NKT-клеток человека in vitro. Вполне реально и возможно вырастить большое количество NKT-клеток человека in vitro, например, путем антигенной стимуляции, которая может быть осуществлена с помощью тетрамеров или клеток, содержащих соответствующие гликолипиды. Кроме того, помимо использования тетрамеров или клеток, необходимо добавить цитокины.

Однако при таких условиях можно экспансивно нарастить большое количество NK T-клеток человека. Кроме того, по крайней мере одна группа в Бостоне заинтересована в терапии такого типа, в отличие от терапии на основе гликолипидов. Другая часть моей лаборатории занимается изучением слизистого иммунитета.

Большинство иммунологов сосредоточили свое внимание на лимфоцитах или лейкоцитах в лимфатических узлах и селезенке. Однако, возможно, большая часть из них на самом деле находится в слизистой оболочке кишечника — в области, где также присутствует, вероятно, от 10¹⁰ до 10¹⁴ или 10¹⁰ до 10¹⁵ бактерий. Таким образом, с микробиологической точки зрения мы в основном стерильны, за исключением нашего кишечника.

Кроме того, в кишечнике находится очень большое количество лейкоцитов. Эти клетки обладают уникальными свойствами и на самом деле изучены недостаточно. Поэтому мы проводим ряд фундаментальных исследований этих клеток.

Кроме того, мы изучаем процесс, который я бы назвал иммунной дисрегуляцией кишечника, приводящей к воспалительным заболеваниям кишечника; по сути, это иммуноопосредованные заболевания тонкого или толстого кишечника, известные как болезнь Крона или язвенный колит. И хотя мы проводим некоторые исследования на людях, большая часть нашей работы осуществляется на мышиных моделях. У нас есть те, которые я считаю очень точными мышиными моделями дисрегуляции слизистой иммунной системы, приводящей к симптомам, характерным для болезни Крона.

Мы изучаем этот процесс, а также способы воздействия на него, в конечном итоге с надеждой на разработку более эффективных методов терапии для пациентов, страдающих этими иммуноопосредованными заболеваниями. Итак, в заключение мы могли бы немного поразмышлять о том, куда будет двигаться иммунология в ближайшие 10 лет или около того, хотя заглянуть на 10 лет вперед действительно сложно. Как бы удивительно это ни звучало.

Я считаю, что слизистая иммунная система на самом деле является одной из основных неизученных областей иммунологии. Хотя всё больше людей и всё больше высокопоставленных исследовательских групп начинают интересоваться исследованиями слизистой иммунологии. Я думаю, что еще одной областью, которая окажет огромное влияние, станет генетика, и в частности генетика человека; по мере того как мы переходим или, я бы сказал, продвигаемся к секвенированию тысячи человеческих геномов, станет возможным проводить исследования отдельных лиц и оценивать, как вариабельность ДНК влияет на иммунный ответ.

В настоящее время большинство наиболее качественных исследований базовых путей протекают на грызунах. Грызуны, и в особенности мыши, имеют критически важное значение для наших исследований. Однако я полагаю, что в будущем, когда мы будем рассматривать сложные аутоиммунные явления или другие процессы, происходящие в организме человека, мы сможем делать это на основе анализа генетических полиморфизмов человека.

Мы сможем оценивать полиморфизмы, а затем использовать эту информацию, чтобы попытаться предсказать, как они повлияют на иммунные ответы, и в конечном итоге перейти к тому, что я и другие называем персонализированной иммуннотерапией или, в более широком смысле, персонализированной медициной. Таким образом, генетика окажет колоссальное влияние. У нас уже есть отличные инструменты в области генетики мышей.

Мы можем нокаутировать любой ген по нашему выбору. Мы можем подавить экспрессию генов в конкретных типах клеток. Мы можем делать удивительные вещи.

Но я полагаю, что в будущем мы сосредоточимся на изучении иммунного ответа и иммунитета с точки зрения реакций человеческого организма.