Высокопроизводительный подход к кометному анализу для оценки повреждения клеточной ДНК
10 мая 2022 г.
Кометный анализ является популярным средством обнаружения повреждений ДНК. Это исследование описывает подход к запуску слайдов в репрезентативных вариантах анализа кометы. Такой подход значительно увеличил количество образцов при одновременном сокращении времени выполнения анализа, количества манипуляций с скольжением и риска повреждения гелей.
Кометный анализ широко используется для оценки генотоксичности. Наш протокол предлагает ряд методологических преимуществ по сравнению со стандартным кометным анализом. Наша технология основана на удержании стандартных комет вертикально и обработке партиями по 25 штук в специально изготовленной стойке.
Это включает в себя электрофорез, поэтому резервуар меньше, использует меньше буфера и имеет встроенное охлаждение. Удерживаемые в стойке, нежные гели на слайдах более защищены и перемещаются от раствора к раствору за 25 секунд. Используя наш протокол комет крови, исследователи могут использовать булавочный укол крови для изучения повреждений ДНК у людей, других видов и широкого спектра потенциально генотоксических воздействий окружающей среды.
Любой из различных форматов для анализа кометы, которые используют слайды микроскопа в качестве твердой опоры для кометных гелей, поддаются нашему подходу. Важнейшей частью этого метода является загрузка образцов после смешивания с агарозой LMP. Образцы должны быть загружены быстро, не образуя пузырьков и покрыты крышкой, сразу же перед затвердеванием.
Для начала подготовьте 0,6% агарозы с низкой температурой плавления в PBS и поместите ее на водяную баню при 37 градусах Цельсия. Пометьте матовый конец предварительно покрытых слайдов именем, датой и информацией о лечении с помощью постоянного маркера или карандаша. Поместите охлаждающую пластину на плоскую скамью и вставьте два замороженных охлаждающих пакета в раздвижной ящик под металлической поверхностью.
Затем поместите слайды на охлаждающую тарелку, чтобы предварительно охладить в течение одной-двух минут. Центрифугируйте и извлеките супернатант из пробирок и немедленно поместите их обратно на лед. Повторно суспендировать ячейку гранулы 200 микролитрами 0,6% агарозы с низкой температурой плавления и перемешать путем пипетки.
Затем добавьте 80 микролитров агарозсодержащих клеток на охлажденный слайд и быстро поместите на гель крышку. Дайте гелю положиться на охлаждающую пластину в течение одной-двух минут. Тем временем приготовьте 500 миллилитров рабочего раствора лизисного буфера и вылейте его в лизисную посуду.
После того, как гели сложатся, быстро снимите крышку, осторожно удерживая скольжение между большим и указательным пальцами и сдвинув крышку с геля. Затем поместите слайды внутрь держателя слайдов со всеми черными метками на слайдах, обращенных в том же направлении. Поместите держатель слайда внутрь лизисной чашки.
Закройте крышкой лизисной посуды и поставьте ее для инкубации. Осторожно извлеките носитель слайда из лизисной посуды, не нарушая гели. Аккуратно поместите держатель для горки в посудомоечную машину, предварительно загруженную ледяной двойной дистиллированной водой.
Убедитесь, что слайды полностью погружены в воду, и оставьте настройку на 30 минут. Поместите замороженный охлаждающий пакет под резервуар для электрофореза для поддержания оптимальной буферной температуры. Затем добавьте в бак рабочий раствор ледяного электрофореза и переложите в него скользящий носитель.
Ориентируйте слайды таким образом, чтобы содержащие клетки гели указывали на катод. Инкубируйте слайды в резервуаре для электрофореза в течение 20 минут, чтобы позволить ДНК расслабиться. Затем включите блок питания, чтобы выполнить электрофорез в течение 20 минут со скоростью 1,19 вольт на сантиметр.
После завершения электрофореза выключите источник питания и извлеките скользящий носитель из бака электрофореза. Дайте носителю слайда стечь на папиросной бумаге в течение 30 секунд. Затем поместите держатель слайда в тарелку, содержащую буфер нейтрализации, и оставьте его на 20 минут.
После этого поместите его в посудомоечную машину, содержащую ледяную двойную дистиллированную воду, и оставьте на 20 минут. После стирки извлеките из воды носитель для горок и дайте горкам высохнуть в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Для регидратации горок переложите держатель слайдов в посудомоечную машину, содержащую ледяную двойную дистиллированную воду, и оставьте ее на 30 минут.
Затем поместите скользящий носитель в окрашивающую посуду, содержащую 2,5 микрограмма на миллилитр раствора пропидия йодида. Закройте крышкой окрашивающего блюда и высиживайте его в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре. После инкубации переложите носитель слайда в отдельную посуду и промыть его ледяной двойной дистиллированной водой в течение 20 минут.
Снимите с тарелки скользящий носитель и полностью высушите его в темноте, либо в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, либо при комнатной температуре. После того, как слайды полностью высохнут, храните их в коробке для слайдов в темноте до готовности к анализу изображения. Кератиноциты человека облучали различными дозами UVA и UVB или лечили 50-микромолярной перекисью водорода, чтобы вызвать повреждение ДНК.
Оптимальное напряжение составляло 1,19 вольт сантиметра, так как оно индуцирует наиболее чувствительный ответ и наибольший процент хвостовой ДНК. Цельную кровь человека облучали различными дозами UVA и обрабатывали различными концентрациями Fpg. Высокопроизводительный анализ щелочных комет показал, что оптимальные уровни повреждения ДНК были индуцированы четырьмя единицами на миллилитры Fpg.
Клеточную линию рака яичников SK-OV-3 лечили комбинацией цисплатина и перекиси водорода. Неэкспонированные клетки не показали повреждений. Воздействие только перекиси водорода генерировало значительный средний момент оливкового хвоста по сравнению с клетками, в которых были индуцированы внутридлиновые сшивки ДНК.
После лечения 100-микромолярным цисплатином внутридлиновые сшивки ДНК увеличивались с пиком через 12 часов, после чего уровни снижались до нуля через 30 ч. Важно поместить пакет со льдом в бак электрофореза и инкубировать слайды в течение 20 минут, чтобы раскрутить ДНК перед электрофорезом. Этот шаг поможет поврежденной ДНК путешествовать по току. Запуск анализа с помощью слайдов, расположенных вертикально, позволил нам автоматизировать анализ кометы.
Кроме того, наш метод упростил анализ кометы для исследований.
Обзор
В данном исследовании представлен усовершенствованный подход к проведению метода комет, широко используемого для обнаружения повреждений ДНК. Благодаря вертикальному расположению предметных стекол и их обработке партиями, данный метод позволяет увеличить пропускную способность образцов, сократив при этом временные затраты и риски, связанные с манипуляциями.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Оценка генотоксичности
- Обнаружение повреждений ДНК
- Оптимизация метода комет
Теоретические основы
- Метод ДНК-комет является важнейшим инструментом в генетических исследованиях.
- Стандартные методы могут быть трудоемкими и требовать значительных временных затрат.
- Повышение пропускной способности и минимизация повреждений геля имеют важное значение для эффективности исследований.
Используемые методы
- Модифицированный протокол метода комет с использованием вертикальных предметных стекол.
- Применение к образцам крови человека и других видов.
- Электрофорез с интегрированным охлаждением и оптимизированным использованием буфера.
Основные результаты
- Новый метод позволяет одновременно обрабатывать 25 образцов.
- Улучшенная защита гелей во время манипуляций.
- Метод валидирован в исследованиях ответа ДНК на повреждения, вызванные воздействием UVA/UVB-излучения и химических агентов.
Выводы
- В исследовании успешно продемонстрирован оптимизированный подход к проведению метода комет.
- Полученные результаты способствуют развитию методологии и исследований в области генотоксичности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Высокопроизводительные платформы для проведения кометного анализа устраняют критическое «узкое место» в оценке генотоксичности, обеспечивая быстрое и масштабируемое количественное определение повреждений ДНК в различных типах клеток. Данная инновация повышает прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и скрининга токсичности, что способствует принятию решений по портфелю с учетом рисков и механистическому снижению рисков. Оптимизированные рабочие процессы и готовность к автоматизации делают этот подход многократно используемым ресурсом для научно-исследовательских конвейеров корпоративного масштаба.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает надежный анализ путей повреждения ДНК для валидации мишеней.
- Поддерживает снижение механистических рисков путем количественной оценки генотоксических ответов на исследуемые соединения.
- Способствует функциональной оценке механизмов репарации ДНК в системах, релевантных конкретным заболеваниям.
- Повышает прогностическую достоверность при отборе активов на ранних стадиях разработки на основе профилей генотоксичности.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную высокопроизводительную количественную оценку повреждений ДНК для скрининга соединений.
- Снижает вариабельность анализа и объем ручных манипуляций, что способствует воспроизводимости и масштабируемости.
- Позволяет проводить быструю параллельную оценку множества условий или воздействий.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующего механистического или фенотипического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет показатели повреждения ДНК со стратегиями трансляционных биомаркеров в доклинических моделях.
- Обеспечивает преемственность от поиска in vitro до подтверждения генотоксических эффектов in vivo.
- Обосновывает решения о продвижении препаратов с учетом рисков путем количественной оценки кинетики повреждения и репарации ДНК.
- Предоставляет сведения о механизмах вызванной соединениями генотоксичности, имеющих значение для патогенеза заболевания.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный высокопроизводительный метод кометного анализа интегрируется в процесс перехода от поиска соединений к доклиническим исследованиям, обеспечивая раннее выявление генотоксических рисков и поддерживая идентификацию и оптимизацию ведущих соединений.
- Открывающая биология: Количественная оценка разрывов и сшивок нитей ДНК для выяснения генотоксических механизмов и биологического риска.
- Скрининг: Обеспечение воспроизводимых количественных данных для приоритизации соединений и сортировки по токсичности.
- Аналитика: Получение стандартизированных показателей (например, Olive tail moment, % tail DNA) для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Связь результатов in vitro с моделями in vivo для согласования биомаркеров и оценки рисков.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление масштабируемой, совместимой с автоматизацией платформы для повторного тестирования на генотоксичность в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при оценке генотоксичности.
- Операционная ценность: оптимизирует рабочие процессы, сокращает расход реагентов и сводит к минимуму ручное манипулирование предметными стеклами.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления генотоксического риска.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов с благоприятным профилем повреждения ДНК.
Особенности реализации
- Требуется опыт в количественном определении повреждений ДНК и интерпретации результатов метода комет.
- Необходимы специализированные штативы для предметных стекол, интегрированная система охлаждения и совместимое оборудование для электрофореза.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов подготовки образцов и анализа.
- Метод применим к различным типам клеток и условиям воздействия при использовании валидированных контролей.
- Для получения достоверных результатов необходимы надежные методы анализа изображений и статистической оценки.
