Использование инъекции клеточного индикатора для исследования происхождения неоинтимообразующих клеток в модели мешковидной боковой стенки крысы
16 марта 2022 г.
Мы выполнили одноточечную инъекцию липофильного индикатора клеток для отслеживания эндотелиальных клеток, после чего последовала артериотомия и наложение швов аневризм боковой стенки на брюшную аорту крыс. Образование неоинтимы, по-видимому, зависело от родительской артерии в децеллюляризованных аневризмах и стимулировалось набором из клеток стенки аневризмы в жизненно важные клеточные стенки.
Используя прямое применение внутриаортального индикатора клеток, мы можем проанализировать роль эндотелиальных клеток, происходящих из родительской артерии, в формировании неоинтимы в двух разных точках времени. Большим преимуществом этой техники является прямая, одноточечная, интерпретирующая инъекция in vivo, которая делает эту модель надежной и воспроизводимой техникой. Перед операцией инкубируют артериальные мешочки от донорских крыс в 0,1% додецилсульфата натрия в течение 10 часов при 37 градусах Цельсия для получения децеллюляризованных аневризм.
Соберите эти мешочки с животных-доноров за несколько дней до операции. Для начала проанализируйте поведение животного и осмотрите слизистые оболочки и тургор в рамках предоперационного клинического обследования. Запишите вес каждого животного.
Для индукции анестезии поместите всех крыс в чистую коробку, обеспеченную кислородом, до потери сознания через пять-10 минут. Проверьте глубину анестезии по отсутствию рефлекса снятия педали. Поместите крыс в лежачее положение и побрейте торакоабдоминальную область электробритвой.
С помощью ленты зафиксируйте лапы крысы на доске, покрытой грелкой, подключенной к авторегулирующему ректальному зонду. Вставьте ректальный зонд в анус крысы для поддержания нужной температуры 37 градусов Цельсия с помощью грелки. Затем установите датчик на правой задней ноге, подключенный к компьютеризированной системе для интраоперационной проверки жизненно важных показателей.
Для перианестетической помощи нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза и накройте их непрозрачной фольгированной маской, чтобы предотвратить высыхание и повреждение от хирургической лампы. Продезинфицируйте хирургическое поле повидон-йодом и задрапируйте хирургическое поле стерильным способом. Поместите микромаг с фиолетовой прокладкой под проксимальную и дистальную части аорты, чтобы лучше визуализировать артерию, как только она отделится от кавальной вены.
Затем защитите брюшко белой марлей. В день операции растворяют два микролитра ячеек-индикатора путем пипетирования в одном миллилитре PBS. Переложите смесь на одномиллилитровой шприц, снабженный канюлей.
Выключите свет в операционной. С помощью микроскопа выполняют одноточечную инъекцию в среднюю вентральную часть аорты микрощипцами, и осторожно вводят один миллилитр гепаринизированного 0,9% физиологического раствора. Осторожно введите индикатор клеток и немедленно выключите работающий микроскоп.
Снова защитите живот мокрой марлей. Дайте красителю высиживаться не менее 15 минут. Затем включите микроскоп и подсветку операционной.
Используйте микрощипцы и микроножницы для выполнения продольной артериотомии так, чтобы ее длина усредняла диаметр собранной аневризмы. Поместите аневризму рядом с аортой перед выполнением артериотомии, чтобы обеспечить правильную длину. Зашить аневризму восемью-10 одиночными швами с помощью нерассасывающегося шва 10-0.
Перед окончательным стежением доставьте катушку с плотностью упаковки один сантиметр. В этой модели может быть выполнено лечение катушкой или стентом. Затем аккуратно снимают временные зажимы, начиная дистально, под непрерывным орошением гепаринизированным физиологическим раствором.
Закройте рану послойным способом. В конце операции отмените анестезию подкожной инъекцией. Пусть каждое эксплуатируемое животное выздоровеет в чистой клетке до полного бодрствования и тепла по мере необходимости с помощью нагревательной лампы.
Объемы вытянутой исходной аневризмы за седьмой и 21-й день существенно не различались для децеллюляризованных или жизненно важных аневризм между группами лечения катушкой или стентом. Вытянутые объемы FU для децеллюляризованных аневризм показали незначительный рост аневризмы в спиральных по сравнению со стентированными аневризмами. Объем вытянутого FU был значительно больше в жизненно важной спиральной, чем в стентированной группе.
Количество клеточно-индикаторных положительных клеток в неоинтиме децеллюляризованных аневризм не существенно различалось между группами стента или спирально обработанных на седьмой день FU, но было значительно выше у стентированных крыс на 21-й день FU.No значительные различия были отмечены у крыс с витал-аневризмой, зашитых либо через семь дней, либо через 21 день, FU.In децеллюляризованные аневризмы через семь дней FU, в тромбе стента, обработанного стентом, оставалось значительно больше клеточных индикаторных положительных клеток по сравнению с группой, обработанной катушкой. Эта разница не наблюдалась при жизненно важных аневризмах на семи днях FU. Не забывайте всегда выключать свет в операционной перед инъекцией индикатора клеток, чтобы предотвратить затухание. Кроме того, дайте инкубировать краситель не менее 15 минут.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается роль эндотелиальных клеток родительской артерии в формировании неоинтимы с использованием метода прямого внутриаортального мечения клеток. В работе используются децеллюляризованные аневризмы брюшной аорты крысы, а также анализируются различия в развитии неоинтимы в зависимости от метода лечения. Основные результаты демонстрируют различия в рекрутировании и удержании клеток в децеллюляризованных и жизнеспособных аневризмах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Сердечно-сосудистая биология
- Хирургические методы на моделях животных
Теоретическая справка
- Формирование неоинтимы имеет решающее значение для понимания процессов заживления и патологии сосудов.
- Различная клеточная динамика в децеллюляризированных и жизнеспособных аневризмах может влиять на конечные результаты.
- Поведение эндотелиальных клеток в моделях аневризмы влияет на выбор терапевтических подходов.
- Методы прямого отслеживания клеток повышают интерпретируемость исследований in vivo.
Цель исследования
- Для анализа рекрутирования эндотелиальных клеток из родительской артерии при формировании неоинтимы.
- Для сравнения результатов различных методик лечения (эмболизация спиралями в сравнении со стентированием).
- Для оценки надежности и воспроизводимости метода одноточечной инъекции для использования в будущих исследованиях.
Используемые методы
- В исследовании использовалось прямое внутриаортальное введение клеточного трекера на модели крысы.
- Децеллюляризированные аневризмы использовали после 10-часовой инкубации в додецилсульфате натрия.
- График работ включал предоперационную подготовку, инъекцию и оценку результатов на 7-й и 21-й дни после операции.
- Критически важные этапы включали мониторинг анестезии и соблюдение хирургической гигиены для обеспечения достоверности результатов.
Основные результаты
- Привлечение эндотелиальных клеток существенно различалось между группами лечения, что влияло на развитие неоинтимы.
- Различия в удержании клеточного трекера наблюдались в децеллюляризированных аневризмах при стентировании по сравнению с эмболизацией спиралями.
- В жизнеспособных аневризмах не было выявлено значимых различий в результатах между группами лечения при последующем наблюдении.
- Исследование подтвердило воспроизводимость модели и выделило важнейшие аспекты для будущих работ.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует, что анатомический источник эндотелиальных клеток существенно влияет на формирование неоинтимы.
- Метод прямого отслеживания клеток представляет собой надежный подход для изучения динамики эндотелия in vivo.
- Полученные результаты дают представление о терапевтических стратегиях для сосудистых вмешательств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Прямое внутриаортальное введение клеточного трекера в модели аневризмы крысы позволяет точно отслеживать происхождение эндотелиальных клеток в процессе формирования неоинтимы, восполняя критический пробел в понимании механизмов заживления сосудов. Данный подход повышает достоверность прогнозов в доклинических моделях при оценке устройств и помогает в выборе терапевтической стратегии для сосудистых вмешательств. Воспроизводимость метода и количественные результаты обеспечивают надежную валидацию мишеней и снижение механистических рисков на этапе перехода от поиска к доклиническим исследованиям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути привлечения эндотелиальных клеток при восстановлении сосудов.
- Обеспечивает механистическую проверку гипотез путем разграничения вклада клеток родительской артерии и клеток стенки аневризмы.
- Способствует функциональной валидации мишеней формирования неоинтимы в поражениях, подвергнутых воздействию устройства.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для количественной оценки миграции и удержания клеток.
- Предоставляет воспроизводимые и интерпретируемые результаты для сравнения различных устройств или методов лечения.
- Позволяет стандартизировать протоколы отслеживания клеток для последующих рабочих процессов скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет доклинические результаты с механизмами заживления сосудов, имеющими значение для патологии.
- Способствует разработке трансляционных биомаркеров путем количественной оценки динамики клеток, формирующих неоинтиму.
- Обосновывает принятие решений о внедрении сосудистых устройств или методов терапии с учетом рисков на основе механистических доказательств.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель трассирования клеток связывает этапы раннего поиска и доклинической валидации, обеспечивая возможность анализа динамики эндотелиальных клеток при повреждении и восстановлении сосудов на основе выдвинутых гипотез.
- Открытия в биологии: позволяет проверять гипотезы о происхождении клеток и участии различных путей в формировании неоинтимы.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты для сравнения эффективности устройств in vivo.
- Аналитика: обеспечивает возможность статистического сравнения количества клеток, положительных по клеточному трекеру, в различных группах лечения и в разные моменты времени.
- Трансляционные исследования: связывает механистические выводы с клинически значимыми процессами заживления сосудов.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет надежную, многократно используемую платформу для оценки новых сосудистых устройств или терапевтических стратегий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях заживления сосудов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые протоколы in vivo.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки устройств или методов терапии за счет обеспечения механистической ясности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов на сосудистое вмешательство с учетом рисков на основе надежных доклинических данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микрохирургическими методами и отслеживанием клеток in vivo.
- Необходим доступ к инфраструктуре для флуоресцентной визуализации и гистологического анализа.
- Требуется строгая стандартизация между группами исследователей для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Адаптация метода для других сосудистых моделей или моделей заболеваний может потребовать оптимизации протокола.
- Результаты зависят от релевантности животной модели и ее трансляционного соответствия биологии сосудов человека.
