Микоризные карты как инструмент для изучения моделей колонизации и грибковых стратегий в корнях Festuca rubra и Zea mays
26 августа 2022 г.
В протоколе здесь описываются методы оценки паттернов и стратегии арбускулярной микоризной колонизации в корнях для двух видов: Zea mays и Festuca rubra. Использование метода MycoPatt позволяет рассчитывать параметры, преобразовывать микоризные структуры в цифровые данные, отображать их реальное положение в корнях.
Метод MycoPatt позволяет глубоко исследовать арбускулярную микоризную колонизацию корней. Микоризные карты указывают на грибковое расширение и представляют реальное положение каждой структуры в виде определенного паттерна. Микоризная колонизация объективно анализируется при разрешении 1%.
Каждый корневой сегмент автоматически преобразуется в цифровую матрицу и генерирует обширную базу данных параметров колонизации. Для начала извлеките корни из холодильника и поместите их на рабочую площадку для размораживания при комнатной температуре. Чтобы выполнить очистку корней, поместите все корни одного растения в банку от 30 до 50 миллилитров, затем приготовьте 10%-ный раствор гидроксида натрия с водопроводной водой и вылейте его в банку, пока он полностью не покроет корни.
Энергично встряхните банку в течение одной-двух минут для однородной дисперсии очищающего раствора в корнях. Дайте корням остаться в очищающем растворе в течение 48 часов. Для промывки корней пропустите содержимое банки через сито.
Промойте корни несколько раз в водопроводной воде до полного удаления очищающего раствора. Далее поместите промытые корни в чистую банку для окрашивания. Затем приготовьте пяти-пятипроцентный раствор чернильного уксуса с водопроводной водой.
Вылейте его в банку, пока он не покроет корни, и встряхните его в течение одной-двух минут. Через 48 часов для частичного обезжиривания промойте окрашенные корни в водопроводной воде на одну-две минуты. Энергично встряхните банку, чтобы удалить лишний раствор для окрашивания.
Повторяйте процедуру до тех пор, пока корни не станут прозрачными для микроскопической оценки. Для сегментации корней поместите окрашенные корни на чешуйчатую разделочную доску. Нарежьте корни на сантиметровые сегменты.
Выберите 15 сегментов для каждого варианта. Далее выкладываем корни на горку для подготовки сегмента, используйте ламинирующий мешочек для покрытия корней и аккуратно измельчайте их, начиная с края. Используйте мягкий пластиковый инструмент для отображения корней на слайде.
Аккуратно снимите ламинирующий мешочек и накройте образец крышкой. Добавьте воду в угол горки с помощью пипетки и дайте воде медленно распределиться по горке. Удалите лишнюю воду бумажным полотенцем.
Для микроскопического анализа используйте микроскоп, оснащенный камерой хорошего разрешения. Анализируйте слайды, начиная с конечности. Захватите каждое микроскопическое поле.
Используйте 10 или 40-кратное увеличение для толстых корней и 40-кратное для тонких корней. После захвата переименуйте каждое изображение с помощью кода, который позволит реальную пост-ассамбляж корневых частей. Используйте презентационное программное обеспечение для проектирования чертежной доски для сборки изображений, установите ширину на два-три сантиметра шире ширины изображения.
После захвата 15 снимков добавьте все захваченные изображения из одного сегмента в порядке их захвата, начиная с одного до 15, и реконструируйте всю длину корневого сегмента. Затем используйте вертикальное выравнивание, чтобы выровнять изображения по центру и убедиться, что каждое изображение следует за предыдущим. Поместите сетку из 10 на 150 ячеек на все изображения, чтобы покрыть весь корневой сегмент.
Кроме того, поместите сетку 10 на 10 на каждом изображении и в каждую ячейку этой сетки вставьте число от одного до шести, если видна арбускулярная микоризная или AM-структура, или оставьте пустым, если структура AM отсутствует. Добавьте таблицу для сетки шириной 10 ячеек и длиной 150 ячеек. Измените таблицу с размерами на ширину изображений, а затем измените длину таблицы, чтобы она включала все изображения.
Для оценки микоризной колонизации используйте уникальный номер для оценки каждого типа структуры, как описано в методе микоризного паттерна. Используйте один для гиф, два для арбускул, три для везикул, четыре для спор, пять для вспомогательных клеток и шесть для точек входа. Оцените каждую наблюдаемую микоризную структуру из каждой клетки ранее нанесенных сеток.
После подсчета баллов вставьте все полученные оценки в таблицу MycoPatt. Используйте функцию копирования вставки для переноса всех оценок из презентации на первый лист с именем Raw Data. Для первичного анализа используйте третий лист с именем Параметры для визуализации результатов в процентах отдельно в трех формах.
Используйте столбцы от A до K для анализа горизонтального изображения колонизации, столбцы от M до W для вертикального изображения колонизации и столбцы от Y до AI для анализа поперечной колонизации для каждого из 15 квадратов 10 на 10 и окончательной средней колонизации. Затем примените определения и формулы, специфичные для каждого параметра. Для получения и извлечения микоризных карт визуализируйте изображение, полученное в результате преобразования кода микоризных структур в цвета на втором листе под названием Graphs.
Затем экспортируйте полученное изображение в лист графика в виде изображения и используйте цветовой код в легенде для анализа микоризных узоров. Для анализа микоризной карты определите наиболее важные структуры и их сборку. Затем опишите паттерн микоризной колонизации, наблюдаемый в анализируемых корнях, за которым следует стратегия колонизации, основанная на наблюдаемом структурном развитии в корне, ветвящемся паттерне и развитии арбускулярных пузырьков.
Этот протокол предоставляет детали микоризных структур с хорошим контрастом между микоризными структурами и корневыми клетками для Zea mays и Festal rubra. Неудачные процедуры очистки и окрашивания привели к неясным микроскопическим изображениям микоризных структур в Festal rubra и Zea mays. Модели микоризной колонизации позволили полностью исследовать механизм колонизации, этот метод обеспечивает глубокое, мелкомасштабное исследование моделей и стратегий колонизации для Zea mays и Festuca rubra с дополнительным визуальным выражением параметров колонизации.
В Zea mays наблюдался сильно колеблющийся колонизационный потенциал в зависимости от стадии развития растения, однако у Festuca rubra процессы колонизации происходили внутри корней и развитие гифальных сетей коррелировало с низкой скоростью развития корней. MycoPatt подходит для картирования арбускулярной микоризной колонизации у любого растения. Также полезно полностью изучить механизм колонизации и оценить грибковую стратегию вдоль корней.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются особенности колонизации арбускулярной микоризой корней Zea mays и Festuca rubra с использованием метода MycoPatt для сбора и анализа данных. Протокол обеспечивает систематическое картирование и оценку микоризных структур с их последующим преобразованием в цифровые форматы для достижения более высокого разрешения и детального понимания.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Характер микоризной колонизации
- Взаимодействия растений и корней
- Распространение грибов в корнях
Теоретическая часть
- Арбускулярные микоризные грибы играют критическую роль в поглощении питательных веществ растениями.
- В исследовании используются общепринятые протоколы для анализа микоризных структур.
- Понимание этих закономерностей может быть полезно при совершенствовании сельскохозяйственных методов и управления экосистемами.
Используемые методы
- Метод MycoPatt для картирования и анализа данных
- Исследование корней Zea mays и Festuca rubra
- Микроскопия и цифровая визуализация для анализа структуры
Основные результаты
- Метод MycoPatt позволяет проводить точный количественный анализ и картирование микоризных структур.
- Данные указывают на вариативность потенциала колонизации у Zea mays, которая заметно зависит от стадии развития.
- У Festuca rubra колонизация происходит преимущественно внутри корней, что демонстрирует иные стратегии структурного развития.
Выводы
- В данном исследовании показана эффективность метода MycoPatt для изучения микоризальной колонизации.
- Полученные результаты расширяют понимание взаимодействий между растениями и грибами, что имеет значение как для экологии, так и для сельского хозяйства.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное картирование микоризной колонизации корней растений позволяет точно оценить эффективность симбиоза и стратегии грибов, что способствует проверке гипотез на ранних этапах исследований взаимодействий растений и микроорганизмов. Метод MycoPatt предоставляет данные с высоким разрешением и четкой пространственной привязкой, которые имеют решающее значение для подтверждения биологических механизмов и обоснования трансляционных исследований в области сельскохозяйственной биотехнологии. Эта возможность повышает точность прогнозирования на стыке фундаментальной биологии и прикладных программ по улучшению сельскохозяйственных культур.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность объективного изучения механизмов симбиоза растений и грибов с помощью цифровых карт колонизации.
- Способствует снижению биологических рисков за счет выявления пространственных закономерностей и структурного разнообразия грибной колонизации.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе комбинаций растений и грибов для дальнейшего исследования.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает стандартизированный и воспроизводимый количественный анализ микоризных структур в сегментах корней.
- Позволяет создавать цифровые наборы данных, подходящие для последующего сравнительного анализа и рабочих процессов скрининга.
- Обеспечивает возможность масштабируемой оценки эффективности колонизации при различных вариантах обработки и на разных стадиях роста.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет картирование колонизации с трансляционными целями по оптимизации признаков сельскохозяйственных культур и исследованию здоровья почвы.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации взаимодействий между растениями и микробами.
- Предлагает механическое снижение рисков для перспективных растительно-грибковых систем перед проведением оценки в полевых условиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод MycoPatt интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, предоставляя цифровые количественные данные о колонизации для проверки гипотез и скрининга.
- Открытия в биологии: обеспечивает высокоразрешающее картирование структур грибов для выяснения путей колонизации и симбиотических стратегий.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные для сравнения эффективности колонизации различных генотипов и вариантов обработки.
- Аналитика: поддерживает статистический анализ параметров колонизации, облегчая сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает лабораторные результаты с доклиническими исследованиями по улучшению сельскохозяйственных культур путем картирования эффективности приобретения симбионтов.
- Корпоративное повторное использование: создает переиспользуемый цифровой рабочий процесс для картирования колонизации корней в различных растительных системах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов в исследованиях взаимодействий растений и микробов.
- Практическая ценность: Стандартизирует оценку колонизации, улучшая воспроизводимость и масштабируемость исследований в различных научных группах.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки систем «растение-гриб» в рамках научно-исследовательских программ.
- Влияние на портфель проектов: Обеспечивает приоритезацию перспективных симбиотических систем с учетом рисков для их последующего внедрения и практического применения.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области микроскопии, цифровой визуализации и количественного анализа данных.
- Необходим доступ к микроскопам высокого разрешения и совместимому программному обеспечению для обработки изображений.
- Требуются стандартизированные протоколы осветления, окрашивания и сегментации корней для обеспечения воспроизводимости.
- Метод применим к различным видам растений, но может потребовать оптимизации с учетом различий в морфологии корней.
- Результативность зависит от качества подготовки образцов для четкой визуализации микоризных структур.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:48
Root Processing, Clearing, and Staining for Microscopy
2:10
Root Processing for Microscopy
2:56
Microscopic Analysis of the Root Samples
3:26
Post-Microscopy Image Assemblage and Scoring of Mycorrhizal Colonization
5:05
Raw Data Analysis and Result Extraction
6:45
Results: Assessment of the Arbuscular Mycorrhizal Colonization Patterns
7:53
Conclusion
