Оптимизированный одномолекулярный анализ для количественной оценки фосфорилирования белка

Этот протокол SiMPull позволяет количественно оценить фосфорилирование белка путем улучшения маркировки и фиксации антител, снижения аутофлуоресценции, обнаруженной в зеленом канале, и обеспечения надежных алгоритмов анализа одной молекулы. Основным преимуществом SiMPull является то, что он позволяет нам исследовать статус фосфорилирования отдельных интактных белков. С помощью этого метода мы можем получить новую информацию, которая недоступна с помощью традиционных методов, таких как вестерн-блоттинг и анализ массовых спецификаций.

У нас есть команда исследователей, которые помогут продемонстрировать протокол. Во-первых, Джулиан Рохо покажет, как пираньи травят покровное стекло. Затем Рэйчел Граттан покажет шаги для покрытия покровного стекла.

А Элизабет Бейли покажет, как рисовать массив и образцы изображений. Для начала вытравите пиранью крышку, осторожно перемешивая реакционный стакан каждые пять минут в течение 30 минут. Нейтрализуют раствор пираньи, постепенно добавляя слабую основу.

Стеклянным стержнем переложите травленую крышку в воронку Бюхнера и промойте в течение пяти минут в двойной дистиллированной воде. Затем поместите крышку в стеклянную банку Коплина и накройте метанолом. Закройте крышку уплотнительной пленкой и внесите ультразвук в ванну на 10 минут.

После обработки ультразвуком опорожните метанол в стеклянную бутылку для хранения. Повторите этот шаг с ацетоном. Промойте крышку трижды двойной дистиллированной водой в банке Coplin.

Слейте воду с крышки и высушите их, размахивая пламенем горелки Бунзена. Поместите крышку в сухую банку Coplin. Затем добавьте раствор аминосилана в банку Коплина, чтобы выполнить аминосиланизацию крышки.

Накройте крышкой и нанесите уплотнительную пленку для защиты от света. Промойте крышку метанолом и выбросьте использованный раствор. Опять же, промойте крышку трижды двойной дистиллированной водой в течение двух минут каждая.

Смажьте лишнюю влагу и полностью высушите воздух в течение 10 минут. Далее нарисуйте сетку массива гидрофобным барьерным пером. Отметьте идентификатор на крышке, чтобы определить правильную ориентацию.

После того, как чернила высохнут, поместите крышку в увлажненную камеру. Повторное суспендирование 153 миллиграммов mPEG и 3,9 миллиграмма биотина-ПЭГ в 609 микролитрах 10 миллимолярного бикарбоната натрия и вихря. Центрифуга при 10 000 х г от одной минуты при комнатной температуре для удаления пузырьков.

Нанесите от 10 до 15 микролитров этого раствора на квадрат, чтобы полностью покрыть массив без переполнения. Храните крышку в камере влажности в темноте в течение трех-четырех часов при комнатной температуре. Затем промойте крышку, окунув их на 10 секунд последовательно в три стакана, наполненных двойной дистиллированной водой.

Удалите всю влагу с крышки с помощью газообразного азота. Храните крышку спиной к спине в конической трубке объемом 50 миллилитров, заполненной азотом, и запечатайте уплотнительной пленкой. Оберните трубку герметизирующей пленкой и поместите ее при минус 20 градусах Цельсия.

Извлеките функционализированные массивы биотина-ПЭГ из морозильной камеры и уравновешивайте их до комнатной температуры. Поместите крышку с массивом лицом вверх над 100-миллиметровой чашкой для культивирования тканей, выстланной герметизирующей пленкой. Инкубируйте каждый квадрат массива с 10 миллиграммами на миллилитр боргидрида натрия в PBS в течение четырех минут при комнатной температуре.

Трижды вымойте PBS. Далее инкубируют с 0,2 миллиграмма на миллилитр NeutrAvidin в T50 в течение пяти минут, после чего трижды промывают T50 BSA. Повторяют инкубацию с двумя микрограммами на миллилитр биотинилированного POI-специфического антитела в T50 BSA в течение 10 минут с последующей промывкой.

Сначала разморозьте лизат путем пипетки. Разбавьте один микролитр лизата в 100 микролитра ледяного холода T50 BSA PPI. Инкубировать лизат на массиве в течение 10 минут с последующей промывкой.

Готовят AF647 конъюгированное антифосфотирозиновое антитело в ледяном холоде T50 BSA PPI и инкубируют на массиве в течение одного часа. Положите каплю нефти на цель. Поместите наносеть на сцену для визуализации.

Используя передаваемый белый свет, сосредоточьтесь на рисунке сетки. Получите серию из 20 изображений сетки, убедитесь, что пиксели не насыщены и сохраните серию изображений как фидуциальную. Расфокусируйте наносеть, чтобы создать воздушный рисунок, получите серию из 20 изображений для калибровки усиления и сохраните изображение как усиление.

Затем получите серию из 20 изображений для смещения камеры, заблокировав весь свет для камеры, и сохраните фон изображения. Чтобы получить простые изображения, сначала очистите масляный объектив и нанесите дополнительное масло на объектив. Закрепите защитную решетку на ступени микроскопа.

Получайте изображения для каждого образца, сначала в дальне-красном канале, а затем флуорофоры с более низкой длиной волны. Проверяйте уровень буфера каждые 30-45 минут и пополняйте его по мере необходимости. Используя этот метод, EGFR-GFP был захвачен из общих белковых лизатов.

Автофлуоресценция гидрофобных чернил использовалась в качестве руководства по нахождению фокальной плоскости образца. Изображения необработанных данных были получены со спектральными каналами, разделенными на чипе камеры. Для сбора данных было дополнительно изучено наложение зеленого и дальнего красного каналов.

Регистрация канала осуществлялась на изображениях, полученных из наносети. Наложение фидуциальных изображений показало неполную регистрацию. Выравнивание осуществлялось путем применения локально-взвешенного среднего преобразования на координатах дальнего красного и зеленого каналов, которое использовалось для регистрации последующих данных SiMPull.

Одиночные излучатели над фоновым количеством фотонов от каналов GFP и AF647 были упакованы, и для идентификации местоположений была выполнена гауссовская локализация. Колокализация EGFR-GFP в F647 была проведена для идентификации фосфорилированных рецепторов. А процент колокализации использовался для определения фракции фосфорилированных рецепторов.

Фоновые обнаружения были уменьшены, когда травленое стекло пираньи обрабатывали боргидридом натрия. Наблюдалось надежное связывание EGFR-GFP в лизате с минимальным неспецифическим связыванием PY99-AF647, демонстрируя сохранение функционализации поверхности с использованием этого метода. SiMPull предоставляет информацию о фосфорилировании белка и может решать широкий спектр самосигнационных вопросов.

Это может улучшить наше понимание передачи сигналов как в нормальных, так и в болезненных состояниях.