Исследование смягчающего воздействия введения Bacillus cereus на колит посредством модуляции кишечной микробиоты

Этот протокол позволяет оценить двунаправленное регулирующее влияние пробиотических добавок на здоровье и получить стабильные и воспроизводимые результаты. Альтернативная модель индуцированного DSS колита была создана с использованием псевдостерильных мышей, чтобы избежать некоторых лабораторных ограничений при использовании стерильных мышей в качестве рецепторов для пробиотиков. Изучение благотворного влияния пробиотиков в этой методике является многообещающим подходом к разработке новых стратегий лечения для облегчения симптомов хронических воспалительных заболеваний.

Для начала приготовьте коктейль из антибиотиков, растворив в питьевой воде ампициллин, сульфат неомицина, метронидазол и ванкомицин. После полного растворения храните растворы при температуре четыре градуса Цельсия. Налейте растворы для коктейлей антибиотиков в бутылку с водой.

Обязательно используйте коричневые флаконы или оберните флаконы алюминиевой фольгой, чтобы защитить растворы антибиотиков от света. Поместите бутылку на клетку для мыши. Чтобы приготовить 2,5%-ный раствор сульфата декстрана, растворите 2,5 грамма ДСС в 100 миллилитрах дистиллированной воды.

Замените питьевую воду на 2,5% раствор DSS в группе мышей с моделью колита. Чтобы оценить положительное влияние B. cereus на облегчение колита, случайным образом распределите мышей по следующим трем группам: контрольную группу, модель индуцированного колита DSS и добавки пробиотика B. cereus для мышей, индуцированных DSS. Чтобы изучить роль микробиоты кишечника в регуляции пробиотических эффектов B. cereus на колит, индуцированный DSS, случайным образом распределите мышей по следующим трем группам: ABX/контроль, ABX/DSS и ABX/B cereus плюс DSS.

Запишите массу тела мышей в качестве исходной массы после введения коктейля антибиотиков. Немедленно обработайте самца C 57 BL шести мышей 2,5% раствором DSS в питьевой воде в течение семи дней. Подготовьте восемь микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 миллилитров, наполненных 900 микролитрами стерильного физиологического раствора.

Пипеткой наберите 100 микролитров логарифмического роста B cereus и растворите в 900 микролитрах стерильного физиологического раствора. Серийно разводят B cereus с помощью пробирок. Нанесите 40 микролитров каждого разбавления на соответствующую агаровую пластину LB с маркировкой с коэффициентом разведения.

Повторите три раза для каждого соотношения разведения. Культивируйте планшеты в инкубаторе с постоянной температурой при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов. Выберите пластины с примерно 20-70 колониями для подсчета.

После количественного определения B. cereus соберите один миллилитр среды B. cereus, содержащей один раз 10 до девятого КОЕ, и центрифугируйте при 8 000 G в течение 10 минут. Затем бактериальные клетки дважды промыть стерильной водой методом центрификации при 8 000 G в течение 10 минут и удалить надосадочную жидкость. Разбавьте концентрированный B.cereus стерильным физиологическим раствором до конечной концентрации два раза по 10 до восьмой КОЕ на 200 мкл.

Пипетируйте разведение вверх и вниз несколько раз, чтобы получить диспергированную суспензию B cereus. Протрите внешнюю сторону иглы для зонда 70% этанолом и поддерживайте нанесение правильной дозы. Чтобы удержать мышей, возьмите их за хвост и крепко возьмитесь за рыхлую кожу спины так, чтобы конец хвоста был зафиксирован между двумя последними пальцами дрессировщика.

Держите мышей в вертикальном положении. Затем осторожно и аккуратно введите иглу для зонда через рот в пищевод. Введите раствор B. cereus, осторожно извлеките иглу и верните мышь в клетку.

Ежедневно измеряйте массу тела мышей и немедленно собирайте образцы кала в стерилизованную центрифужную пробирку. Определите каловую скрытую кровь по анализу кала на скрытую кровь. Соберите 10 миллиграмм образца кала на палочку-аппликатор.

Положите образец на тестовую карту и нанесите на карту тонкий мазок. Откройте задний клапан и нанесите проявитель на мазок. Зафиксируйте мышей лежа на операционном столе и откройте брюшную полость.

Отделите всю толстую кишку хирургическим путем и измерьте длину с помощью линейки. Затем аккуратно промойте толстую кишку пятимиллилитровым шприцем, наполненным предварительно охлажденным PBS. Удалите воск и увлажните отделы толстой кишки.

Далее окрашиваем срезы толстой кишки гематоксилином и эозином. Позвольте двум независимым экспериментаторам оценить гистологические показатели образца под световым микроскопом, окрашивание гематоксилином и эозином показало, что в ткани толстой кишки мышей с модельным колитом наблюдалась потеря крипты, повреждение бокаловидных клеток, воспалительная инфильтрация клеток и потеря эпителия. Лечение B. cereus улучшило гистопатологическое повреждение, вызванное DSS.

Гистопатологические показатели у мышей с колитом были достоверно выше, чем в контрольной группе. Тем не менее, гистопатологические показатели в группе B. cereus были значительно ниже, чем у мышей с колитом. Мыши были случайным образом разделены на три группы, потеря массы тела, баллы DAI и гистопатологические баллы были выше, а длина толстой кишки была короче в группе ABX/DSS по сравнению с мышами в группе ABX/контрольной группе.

Потеря массы тела, длина толстой кишки, баллы DAI и баллы гистопатологии статистически не различались между группами ABX/DSS и ABX/B cereus плюс DSS. Полученные результаты косвенно свидетельствуют о том, что микробиота кишечника играет ключевую роль в положительном влиянии B. cereus на колит. Одним из наиболее важных этапов является использование метода Bacillus cereus методом зонда для построения моделирования колита у мышей.

Лечение Bacillus cereus устранило колит, вызванный DSS, что привело к созданию основы для последующего исследования пробиотиков для лечения колита.