Генерация мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировка в линию скелетных мышц

Мы описываем наш протокол по выделению мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и надежный метод дифференциации их в линию скелетных мышц. Этот метод позволяет изолировать мезенхимальные стволовые клетки, обладающие высокой жизнеспособностью и теплом, практически без загрязнения клеток эндотелиального происхождения и эффективно индуцировать миогенную дифференцировку при этих заболеваниях. Перекрут шнура и консистенция мукоидов затрудняют обращение со шнуром.

Покажем, как обработать пуповину, чтобы не соскоблить желе Уортона, и исключить эндотелиальные клетки из популяции. После сбора ткани пуповины во время доставки перенесите кусок ткани пуповины из коллекционной трубки в посуду площадью 10 квадратных сантиметров, обработанную культурой, и тщательно вымойте ткань свежим PBS. Чтобы ухаживать за перекрутом пуповины и слизистой поверхностью, зафиксируйте ткань парой щипцов, удерживаемых в одной руке.

Используя скальпель, разрезайте ткань пуповины вертикально вдоль ее продольного доступа, чтобы получить два полуцилиндрических куска. В этот момент наблюдают за пупочными артериями и венами. Используя скальпель, удалите кровеносные сосуды, соскоблив их в одном направлении с поверхности и промойте ткань пуповины в PBS, чтобы удалить всю остаточную кровь, связанную с тканью.

Измельчите каждую половину ткани пуповины на фрагменты размером 0,5 кубического сантиметра. Поместите фрагменты с просветной поверхностью вниз на блюдо и высиживайте блюдо кратковременно в течение 10 минут. В конце инкубации добавляют 20 миллилитров среды, содержащей модификацию MEM Alpha, осторожно по бокам чашки, содержащей ткань пуповины.

Убедитесь, что экспланты не смещены от своей ориентации, и добавьте лишнюю среду, чтобы учесть фракцию, которую тканевые экспланты будут впитывать во время инкубации. Затем поместите блюдо в инкубатор на три дня. После окончания инкубации добавьте свежую среду в культуру и убедитесь, что культуры защищены от ударов и движения эксплантов при обработке блюд.

Через неделю, используя стерильные щипцы, удаляют фрагменты тканей по отдельности и выбрасывают их, используя соответствующие пакеты биологической опасности для утилизации. Сохраните существующую среду и добавьте 10 миллилитров свежей питательной среды. Заменяйте питательную среду каждые четыре дня, пока отдельные колонии не достигнут слияния 70% После окрашивания клеток, как описано в рукописи, проанализируйте меченые клетки методом проточной цитометрии и определите процент CD105 CD90 положительных и CD105 CD73 положительных клеток.

Анализируйте CD105 положительные и CD34 CD45 отрицательные клетки отдельно. Покрыть тканевую культуральную пластину 0,01% коллагеном и 20 мкг на миллилитр ламинина в PBS и поместить ее на коромысло в течение как минимум четырех часов при комнатной температуре. После инкубации удаляют коллаген и промывают пластину PBS, затем пластинчатые uMSC с плотностью 10 000 клеток на квадратный сантиметр в питательной среде.

Как только клетки достигнут 70%-ной конфюляции, аспирируйте питательную среду и дважды промойте культуральную пластину PBS. Чтобы определить кинетику миогенного прогрессирования, добавляйте среду M1 через день в культуры и анализируйте uMSCs на экспрессию тяжелой цепи pax7, MyoD, миогенина и миозина через два дня, четыре-пять дней, шесть-семь дней и десять-четырнадцать дней соответственно. uMSCs отображают экспрессию CD105 и CD90 и не экспрессируют гемопоэтические маркеры CD34 и CD45.

UMSC также были положительными для экспрессии маркера uMSC CD73, что указывает на то, что uMSC выражали несколько ключевых маркеров. uMSC показали экспрессию pax7 в течение первых двух дней после добавления M1, а затем экспрессию MyoD в течение первых четырех дней добавления M1. Клетки экспрессируют белок миогенина через шесть дней дифференцировки, с последующей экспрессией тяжелой цепи миозина между 10 днями и 14 днями индукции дифференцировки.

970 генов были повышены в ответ на индукцию миогенной дифференцировки по сравнению с недифференцированными uMSC. Больше миогенных генов было повышено в uMSCs, полученных из пуповинной ткани, по сравнению с uMSCs, полученными из пуповинной крови. Как пуповинная ткань, так и пуповинная кровь показали повышение регуляции генов, связанных с белками цитоскелета, связанными с связыванием актина и саркомерной сборкой, транспортерами, связанными с сократительной функцией, поддержанием мышечной массы, передачей сигналов кальция и ферментативной функцией.

Соберите ткань в асептическом состоянии и поддерживайте стерильную культуру. Шнур должен быть внешне смыт 70% этанолом и обработан как можно быстрее. Многие регенеративные методы лечения требуют большого количества клеток из ранних проходов.

Он также может быть использован в качестве модели для имитации всей сухой среды и отражения постнатального метаболизма.