Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Здравствуйте, меня зовут Мэтт Луи. Я постдокторант в лаборатории Лесли Сол в Университете Рокфеллера. Сегодня я хотел бы рассказать вам об экспериментах, которые мы проводим для изучения хемотаксиса личинок.

Задача, которая нас интересует, довольно проста. Она фактически представлена здесь, в данной установке. Я только что перенес группу личинок Joseph на эту поверхность агарозы.

Эта среда довольно враждебна, и животные находятся на грани голода. Каким-то образом этим животным потребуется найти путь к ближайшему источнику пищи; здесь находятся бананы, выделяющие запах, который привлечет личинок. Данная среда не является идеальной для изучения поведения хемотаксиса, поэтому первым улучшением станет замена банана химическим веществом.

Данное химическое вещество представляет собой изоацетат, один из основных ароматизаторов, определяющих запах банана. Мы используем этот искусственный ароматизатор, чтобы обеспечить более точный контроль над ольфакторным стимулом. Следующим улучшением является использование закрытой среды, чтобы предотвратить колебания в распределении вещества.

Перед вами анализ, который мы используем в лаборатории уже довольно долгое время. Это чашка Петри с агаром на дне. Агар идеально подходит для хемотаксиса личинок, так как он поддерживает необходимый уровень влажности.

По обеим сторонам планшета расположены крышки из тефлона; сейчас мы внесем изамацетат на одну сторону, а на другую ничего не добавим. После этого чашку Петри следует закрыть, подождать некоторое время для диффузии вещества, а затем открыть ее. После этого в чашку помещают животное и позволяют ему передвигаться в течение определенного периода времени.

Данный анализ основан на предположении, что при введении теодора с одной стороны чашки создается градиент, который устанавливается достаточно быстро и остается стабильным на протяжении всего теста. Основная проблема заключается в том, что существование градиента в чашке никогда не было продемонстрировано. Вполне возможно, что вскоре после добавления теодора в чашке происходит его гомогенное распределение, в результате чего градиент становится очень пологим, или же для установления градиента требуется несколько минут.

Это, разумеется, будет зависеть главным образом от давления пара используемого вещества. Второй вопрос связан с тем, что именно количественно определяется в ходе эксперимента. Представьте, что животное начинает движение отсюда, от отметки X, и через три минуты оказывается у этой концевой пластины, отмеченной красным X. В таком случае возможны два подхода.

Один из возможных вариантов заключается в том, чтобы фиксировать только конечное положение животного по истечении определенного периода времени, например, трех или пяти минут. В таком случае будет зафиксирована информация только о начальном и конечном положении, однако мы полагаем, что важно иметь хорошее разрешение данных о поведении животного с течением времени. Например, животное могло почти не сдвинуться с начального положения к конечному, как показано здесь, или же оно могло находиться в области вокруг теодора значительную часть времени и вернуться назад до завершения испытания.

Выводы, которые можно сделать из этих двух ситуаций, будут совершенно разными. В одном случае животное могло не отреагировать на стимул, тогда как в другом оно определенно отреагировало. Мы стремимся добиться двух улучшений: во-первых, контролировать форму и стабильность другого градиента в арене.

Во-вторых, отслеживайте поведение животного в режиме реального времени и сохраняйте всю полученную информацию. В следующей части Сильвия продемонстрирует, как мы готовим серию разведений. Меня зовут С ти.

Я работаю научным ассистентом в лаборатории VAs под руководством Material Lui. Сегодня я покажу вам, как подготовить материалы для системы камер, которую мы используем для отслеживания животных. Основная особенность нашей системы камер заключается в том, что мы используем запахи, распределенные в воздухе.

Это означает, что, например, если используемые нами агарозные планшеты не будут плоскими, могут возникнуть колебания концентрации между экспериментами, что приведет к появлению шума в системе. Поэтому я покажу вам и дам несколько небольших советов, как попытаться уменьшить уровень шума в системе. Материалы для приготовления разведения запаха: стеклянная банка, желательно из темного стекла (в случае использования светочувствительных запахов), и аликвота интересующего вас запаха.

Стеклянные пипетки для подготовки данной аликвоты и подходящий механический дозатор. Затем наконечники для пипеток с парафиновым покрытием, стандартный автоматический дозатор и небольшие флаконы для разведения. Последние должны быть стеклянными, желательно из темного стекла, а также аналитические весы для обеспечения точности измерений и снижения погрешности между экспериментами.

Поскольку запахи характеризуются высокой летучестью, а некоторые из них токсичны, данные манипуляции проводятся в вытяжном шкафу. Первым этапом подготовки разведения запаха является отбор аликвоты вещества, которое будет разбавляться. Для приготовления точных разведений и минимизации вариативности между экспериментами необходимо всё взвешивать.

Начните с маркировки; мы приготовим этилбутират в концентрации 1 M. Сначала подготовьте парафиновое масло. Парафиновое масло очень вязкое, поэтому важно погружать кончик пипетки в масло как можно меньше — лишь настолько, чтобы можно было забрать жидкость, не создавая пузырьков.

Затем рекомендуется вытереть излишки парафинового масла с бортика флакона. Повторим: поскольку парафиновое масло обладает высокой вязкостью, крайне важно медленно вводить его в виалу. После того как вы перенесли парафиновое масло во флакон, не выбрасывайте наконечник сразу, так как в его нижней части может остаться еще некоторое количество вещества.

Рекомендуется заранее подготовить расчетную таблицу перед началом разведения, в которой будут указаны необходимый объем и вес жидкого парафина, а также вес и объем используемого одоранта. Это позволит вам с помощью весов проверить, достаточно ли у вас жидкого парафина и одоранта. При необходимости добавьте больше жидкого парафина и снова проведите взвешивание до достижения нужного значения.

Как только вы определите правильный вес базового масла, вам останется добавить душистое вещество, используя те же принципы. Итак, теперь я покажу, как подготовить личинок для трекинга.

Обычно мы используем личинок шестидневного возраста. Это связано с тем, что они достаточно велики, чтобы программное обеспечение легко их распознавало, и при этом остаются очень активными. Чтобы определить, не слишком ли стары личинки для трекинга, достаточно проверить, не ползут ли они по стенкам. Если личинки поднимаются по стенкам, значит, они слишком старые и не будут проявлять достаточной активности.

Первым этапом подготовки личинок является их погружение в 15% раствор сахарозы. Мы используем 15% раствор сахарозы, чтобы личинки всплывали в этом растворе, в то время как корм будет либо частично растворяться в нем, либо оседать на дно. Налейте достаточное количество сахарозы, чтобы уровень жидкости был примерно на 2,5 см ниже края вашего флакона или пробирки.

Затем возьмите шпатель. Вы уже можете видеть всплывающих личинок; аккуратно перемешайте корм, чтобы извлечь животных, которые зарылись в него, немного закрутите содержимое, чтобы отделить личинок от корма, и оставьте их на пару минут. После того как корм и личинки достаточно разделятся, возьмите предварительно промаркированную чашку Петри и перелейте их в более глубокую часть.

Сохраните крышку чашки Петри, так как вы наполните ее водой и будете использовать в качестве емкости для отслеженных личинок, чтобы разделять тех, кто уже прошел трекинг, и тех, кто еще нет. После того как вы перенесли личинок в чашку Петри, необходимо подождать 30 минут, чтобы они адаптировались к сахарозе и достигли состояния голодания. Это обеспечит более стабильное поведение личинок в установке для трекинга по истечении этих 30 минут адаптации.

Время обработки сахарозой — подходящий момент для подготовки планшетов для трекинга. Перед нами крышки 96-луночных планшетов. Их можно приобрести отдельно; здесь используется 3% раствор агарозы, который был предварительно нагрет.

Мы используем 3%, так как такая концентрация препятствует зарыванию личинок, но при этом гель достаточно плотный, чтобы они могли по нему передвигаться и оставаться увлажненными на поверхности каждой чашки. Необходимо пипетировать 25 мл агарозы. Важно постараться избежать образования крупных пузырьков воздуха в геле.

Также важно размещать планшеты на ровной поверхности, иначе гели могут получиться под наклоном, что может повлиять на поведение личинок. После застывания гелей мы накрываем планшеты крышками и оборачиваем их пищевой пленкой, чтобы предотвратить высыхание. Это позволит поддерживать их в надлежащем состоянии для отслеживания в течение нескольких дней.

В данной серии видео я представлю вам наш поведенческий анализ, который несколько отличается от анализа в чашках Петри, о котором я рассказывал ранее. Вам понадобятся крышки для 96-луночных планшетов, а также планшеты с агаровым слоем. Аналитическая система состоит из трех крышек, которые устанавливаются друг на друга стопкой.

Первый слой пуст и служит исключительно для изоляции системы от поверхности, на которой она расположена. Второй слой представляет собой поверхность с агаром. Здесь животные будут размещены на поверхности, и сейчас, как я покажу далее, мы введем препарат в планшет.

Важно использовать новую чистую крышку при каждой загрузке theodor. Это необходимо для предотвращения перекрестного загрязнения между отдельными экспериментами. Вам также потребуется другой разбавитель.

Обычно мы не используем краситель для загрузки теодора, но здесь я воспользуюсь им для наглядности. Это высокая концентрация теодора. В то время как этот раствор сильно разбавлен, моей целью будет создание градиента вдоль линии.

Повторите эту фразу; мы хотим, чтобы концентрация увеличивалась слева направо. Для этого я буду использовать несколько капель раствора, помещенных в конденсационное кольцо с возрастающей концентрацией. Я начну с самой высокой концентрации, которую следует поместить с края.

Важно равномерно распределить его по кольцу. Теперь я перехожу к следующей концентрации, которая разведена в два раза по сравнению с первой, и наношу ее в это кольцо. Таким образом, у меня получается шесть капель.

В первой пробирке концентрация составляет, скажем, 1. Во второй — 0,5, что в два раза меньше, чем в первой. В третьей концентрация составляет 0,25 и так далее.

Таким образом, мы получаем геометрическую прогрессию вдоль линии. Следующий шаг заключается в переворачивании этой крышки на поверхности AAL, после чего за счет поверхностного натяжения все капли остаются подвешенными к верхней части крышки. Мы разработали метод на основе инфракрасной спектроскопии для измерения концентрации всех веществ в планшете.

Применяя этот метод, мы смогли показать, что при наличии геометрического ряда вдоль линии источника одоранта здесь, в итоге получается концентрация одоранта по всей длине, которая увеличивается экспоненциально, как показано здесь, а по ширине планшета мы имеем профиль с пиком непосредственно под линией одоранта. Вот как выглядит фактическая геометрия градиента.

Если рассматривать концентрацию теодора в воздухе, положительным моментом является то, что нам удалось продемонстрировать стабильность геометрии его градиента в течение как минимум 15 минут. После установки верхней крышки мы ждем 30 секунд для установления градиента. Затем мы помещаем животное в арену.

Животное помещают под линию другого конца между третьей и четвертой позициями; для переноса личинок из раствора сахарозы на поверхность агара мы используем маленькую булавку. Перенос осуществляется путем захвата личинки головкой булавки. Мы быстро открываем крышку и помещаем личинку на поверхность агара.

Затем закройте крышку. Важно свести к минимуму время, в течение которого крышка остается открытой. Далее запишите движения животного в течение трех или пяти минут.

Проводится непосредственная запись. В данной установке для трекинга используется камера, подключенная к компьютеру. Для сбора данных о перемещении животного и их сохранения в виде цифрового файла применяется программное обеспечение для трекинга изображений Aton vision от компании Nordis.

Теперь мы приступаем к поведенческому эксперименту. У нас есть крышка со слоем аромавещества и подготовленные разведения.

Диего застрял на первой крышке. Перед загрузкой теодора важно перемешать содержимое каждого флакона на вортексе. Мы используем наши разведения, где самое минимальное находится слева, а самое максимальное — здесь, справа.

Все шесть капель будут нанесены на планшет одновременно. Чтобы избежать потери запаха, здесь используется многоканальный дозатор; из каждого образца разведения берется по 10 µL пахучего вещества, и все образцы наносятся одновременно. После нанесения крышку переворачивают и прижимают к поверхности агарозы.

Градиент был создан на планшете в течение последних 30 секунд, как я показывал вам ранее. Теперь я помещу животное на поверхность Диего. Сразу после помещения животного я начну запись.

Животное находится здесь, и в данный момент отслеживается его перемещение. Как видно, животное следует по линии распространения одоранта и движется к точке с максимальной концентрацией градиента. Помните, что концентрация увеличивается слева направо по экспоненте.

Как видно, направление движения постоянно корректируется. Относительно стимула животное достигло точки наивысшей концентрации градиента, после чего мы удаляем его с планшета. Животное переносится на другой планшет, чтобы гарантировать, что одна и та же особь не будет отслеживаться дважды подряд.

После введения новой личинки и начала новой записи мы следуем определенным правилам трекинга. Мы прекращаем трекинг, как только животное достигает ряда с самой высокой концентрацией на планшете, который соответствует этому, вот этому ряду. Кроме того, если животное касается стенки, трекинг прерывается, так как мы хотим избежать любых помех.

Первый вопрос, который мы рассматривали, был довольно простым. Нам нужно было выяснить, может ли животное чувствовать запах при определенной концентрации. Чтобы провести такой тест, мы обычно используем один источник запаха вместо нескольких.

Это позволяет вам иметь одну степень свободы при изменении концентрации в капле Теодора. Например, здесь у вас капля с высокой концентрацией, а здесь — капля с низкой концентрацией. Обычно мы помещаем животное на поверхность Диего прямо под каплю Теодора и наблюдаем, способно ли животное обнаружить ее присутствие и остаться в ее окрестностях.

Теперь я хотел бы продемонстрировать более продвинутое использование нашего метода анализа. Представьте, что у вас есть одна капля упорядоченного состояния, и вы записываете несколько траекторий, которые наложены друг на друга; здесь их три. Одна из особей оставляет этот зеленый след.

Здесь представлена оранжевая траектория, которая смещена от центра, и розовая траектория, которая, по всей видимости, представляет собой движение животного по кругу вокруг источника. Мы полагаем, что анализ деталей этих траекторий может дать важную информацию. По этой причине мы импортируем траекторию в MATLAB как серию координат положений и выполняем последующий анализ с помощью MATLAB.

Здесь представлено расстояние до источника, вероятно, как функция времени. Для трех траекторий, показанных ранее, видна зеленая траектория, которая остается очень близко к источнику, и оранжевая траектория, характеризующаяся значительно более высоким уровнем шума.

Затем видна эта фиолетовая траектория; примечательно, что животное удалилось от источника, чтобы остаться на определенном расстоянии, что, вероятно, соответствовало оптимальной концентрации. Здесь представлена иллюстрация 10 траекторий животных, которые не способны чувствовать запах. Это мутанты или мутанты 3B, которые являются не-обоняющими.

Как видно, все эти траектории показывают, что животные не смогли обнаружить источник запаха и просто ушли от него. В резком контрасте с этим мы записали здесь 10 последовательных траекторий для животных с нормальным обонянием. Эти животные, разумеется, способны чувствовать запах, и, как видно, все они скапливаются непосредственно под источником дезодоранта.

Представленные 20 траекторий были фактически получены без знания принадлежности животных к определенным группам. Это демонстрирует эффективность и надежность нашего анализа. Чтобы определить, способны ли определенные мутанты чувствовать запах в условиях экспоненциального градиента, мы регистрируем несколько треков, чтобы оценить, насколько хорошо животные способны следовать за стимулом на другом конце.

Сейчас я продемонстрирую вам 15 траекторий, записанных по отдельности; как видите, животные отлично справляются с тем, чтобы следовать за стимулом в сторону линии на другом конце. Теперь мы хотим провести простой контрольный эксперимент. Вполне возможно, что животные в экспоненциальном градиенте следовали вдоль линии просто потому, что присутствовал какой-то стимул независимо от его концентрации, и животные просто двигались по прямой.

Таким образом, чтобы показать, что они действительно вычисляют концентрацию или какой-то связанный с ней параметр и используют это для управления своим движением, мы создали геометрию, напоминающую крышу. Личинку вводят сюда, как обычно, и мы ожидаем, что она будет двигаться вдоль линии, затем обнаружит, что после этой точки концентрация падает, и вернется к ней. Мы провели данный тест с пятью животными.

Мы собрали данные о траекториях и теперь представляем их, наложенными на этот слайд. Как видно, животные начали движение отсюда, перемещались вдоль линии, затем исследовали область, соответствующую самой высокой концентрации, и в основном оставались в ней. Это убедительно свидетельствует о том, что они способны определять разницу концентраций в режиме реального времени с помощью анализа с одним источником.

Нам удалось задать один основной вопрос: может ли животное обнаружить запах при определенной концентрации с помощью многоисточникового устройства? Таким образом, у нас появилось больше возможностей для изменения формы градиента и определения того, способно ли животное использовать эту информацию.

Я хотел бы проиллюстрировать эту идею, проведя простой эксперимент. В градиентах, которые мы создавали до сих пор, вдоль линзы наблюдалась экспоненциальная форма. Теперь возникает вопрос: если мы усложним задачу для клеток, сделав концентрацию линейно возрастающей вдоль линзы, смогут ли они по-прежнему найти путь к противоположной конечной линии?

На этом графике представлены два типа градиента. Мы протестировали экспоненциальный градиент, обозначенный пурпурным цветом, и линейный градиент, обозначенный зеленым. Это линейный градиент; далее я укажу различные концентрации ацетата изама при разведении в родильном масле.

Это арифметическая прогрессия. У нас создается линейный градиент, и, как видно, его наклон довольно пологий по сравнению с экспоненциальным градиентом здесь, где концентрация на краях также составляет 0.5, но поднимается до 0.03. Вопрос в том, способны ли navi к хемотаксису при таком пологом градиенте?

Здесь представлена фактическая концентрация ацетата, использованная в шести каплях для экспоненциального и линейного градиентов. Как видно, несмотря на то, что максимальные концентрации в обоих случаях для линейного градиента одинаковы, минимальная концентрация здесь довольно высока. Мы провели эксперимент с линейным градиентом; здесь представлены 15 траекторий животных дикого типа, и, по нашему мнению, вполне очевидно, что эти животные смогли обнаружить линейный градиент и следовать за этим сигналом вдоль линии дезодоранта.

Думаю, наша позиция ясна. Прежде чем завершить, я хотел бы кратко рассказать о перспективах развития данной системы трекинга. Хотя эта установка позволяет реализовать множество интересных задач — например, наблюдать за сложным поведением личинок в течение более длительного периода времени в большем масштабе, — у нее есть определенные ограничения.

Например, вы ограничены размером планшета, что накладывает ограничения на продолжительность отслеживания и сложность наблюдаемого поведения. Было бы полезно разработать систему, в которой планшет был бы больше или в которой границы планшета вообще не были бы ограничивающим фактором. Другая проблема заключается в том, что с имеющимся в данный момент программным обеспечением трудно отслеживать более одного животного одновременно, поэтому наблюдение за поведением популяции в режиме реального времени невозможно.

Еще одним интересным аспектом поведения, который мы не можем проверить с помощью данной установки, являются фактические трехмерные перемещения личинок в пространстве. При отслеживании животных вы заметите, что, например, достигнув капли пахучего вещества, они могут приподнять голову или водить ею из стороны в сторону, пытаясь обнаружить изменения концентрации. Возможно, в настоящее время это неосуществимо с нашей конкретной установкой, поэтому было бы полезно разработать решение, которое позволило бы нам это сделать.