Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Здравствуйте, меня зовут Мэтт Луи. Я являюсь научным сотрудником в лаборатории Лесли Сала в Рокфеллеровском университете. И сегодня я хотел бы рассказать вам об экспериментах, которые мы проводили по изучению хемотаксиса личинок.

Проблема, которая нас интересует, достаточно проста. На самом деле он представлен здесь в этой конфигурации. Я только что перевез группу личинок Джозефа на эту поверхность агроса.

Эта среда довольно враждебна, и они близки к голоду. Каким-то образом этим животным нужно будет найти дорогу к ближайшему источнику пищи, и вот какой-то банановый запах, который привлечет личинок. Эта среда не идеальна для изучения поведения хемотаксиса, поэтому первым усовершенствованием будет замена банана химическим веществом.

Это химическое вещество является изоацетатом и является одним из ароматизаторов, которые преобладают в бананах. Таким образом, это наш искусственный ароматизатор, и, используя его, мы гораздо лучше контролируем обонятельный стимул. Следующее усовершенствование заключается в использовании закрытой среды и попытке предотвратить таким образом колебания в другом распределении.

Вот анализ, который мы использовали в лаборатории в течение довольно долгого времени. Это чашка Петри с поверхностью агарро на дне. Агарро идеально подходит для личинок и химиоатак, потому что сохраняет их увлажненными.

С двух сторон пластины вы найдете еще одну крышку, сделанную из тефлона, и то, что мы сейчас собираемся сделать, это ввести ацетат исама с одной стороны и без порядка с другой стороны. Как только это будет сделано, идея состоит в том, чтобы закрыть петро-чашку, подождать немного времени, пока теодор рассеется, а затем открыть тарелку. Вводим сюда животное, и мы позволяем ему двигаться в течение определенного периода времени.

Этот анализ основан на предположении, что при введении теодора с одной стороны чашки мы получаем градиент, который довольно быстро устанавливается и будет оставаться стабильным в течение всего периода испытания. Теперь главная проблема в том, что никто никогда не демонстрировал, что градиент существует в пластине. Вполне может случиться так, что очень быстро после добавления теодора вы получите равномерное распределение теодора в пластине таким образом, что градиент будет очень неглубоким, или может случиться так, что потребуется несколько минут для установления градиента.

Это, конечно, будет зависеть в основном от давления паров используемого теодора. Второй вопрос связан с тем, что количественно определяется в ходе эксперимента. Представьте себе, что животное начинает отсюда, с крестика, и через три минуты на этой торцевой пластине оказывается красный крестик. Теперь есть два возможных подхода.

Единственное, что вы можете сделать, это записать окончательное положение животного только через определенный промежуток времени, три или пять минут. Тогда единственная информация, которую вы можете получить, — это положение старта, и мы считаем, что важно иметь хорошее разрешение о поведении животного с течением времени. Например, животное с трудом могло переместиться из исходного положения в конечное, как здесь, или оно вполне могло посещать область, окружающую теодор, в течение значительного периода времени и вернуться туда до окончания испытания.

Вывод, который мы можем сделать из этих двух ситуаций, очень разный. В одном случае животное могло не реагировать на раздражитель, в то время как в другом случае оно точно отреагировало. Два улучшения, которых мы пытаемся достичь, это, во-первых, контроль формы и стабильности другого градиента на арене.

Во-вторых, отслеживать поведение животного в режиме реального времени и хранить всю эту информацию. В следующей последовательности Сильвия расскажет вам, как мы готовим разведение заказа. Меня зовут С. Ти.

Я работаю научным сотрудником в лаборатории VA и работаю с материалом lui. Сегодня я покажу вам, как подготовить материалы для камерной системы, которую мы используем для слежения за животными. Основная проблема с нашей системой камер заключается в том, что мы используем запах, диспергированный в воздухе.

Это означает, что, например, если пластины agros, которые мы используем, не плоские, вы можете получить колебания и концентрацию между экспериментами, что приведет к появлению шума в системе. Поэтому я покажу вам и дам небольшие советы, чтобы попытаться уменьшить шум в системе. Таким образом, материалами для приготовления разбавления запаха является стеклянная банка, предпочтительно затемненное стекло на случай, если вы используете легкие реактивные запахи с аликвотой запаха, который вас интересует.

Стеклянные пипетки для приготовления этой аликвоты и соответствующий механический пипетка вспомогательны. Затем наконечники для пипетки парафинового масла, стандартная трубка для пипетки и маленькие флаконы для разведения. Опять же, это должно быть стекло и желательно затемненное, а затем весы для точных измерений и снижения шума между экспериментами.

Поскольку запахи очень летучие, а некоторые из них токсичны, их делают в капюшоне. Первым шагом к устранению разбавления запаха является устранение запаха, который вы собираетесь разбавлять. Чтобы приготовить точные разведения и свести к минимуму разброс между экспериментами, необходимо все взвесить.

Итак, начните с маркировки, собираясь получить концентрацию этилбутирата в один моляр. Сначала вы готовите парафиновое масло. Парафиновое масло очень вязкое, поэтому важно стараться погружать кончик пипетки как можно меньше в парафиновое масло, ровно настолько, чтобы иметь возможность всасывать парафиновое масло без образования пузырьков.

Затем хорошо вытереть лишнее масло парены с боковой стороны бутылки. Еще раз, поскольку пареновое масло вязкое, очень важно медленно выпускать его во флакон. После того, как вы налили пара-масло в бутылку, не выбрасывайте наконечник сразу, потому что на дне наконечника соберется еще больше масла.

Хорошо подготовить лист расчетов перед тем, как начать разбавлять, где вы уже измерили объем паренового масла, которое вы собираетесь добавить, а также вес, а затем проделайте то же самое для вашего запаха с также весом. Таким образом, вы можете проверить по накипи, которая у вас есть, все парафиновое масло, которое вам нужно, а также весь запах. При необходимости вы наливаете еще паренного масла и отмеряете до тех пор, пока не получите нужный вес.

После того, как у вас есть правильный вес паренного масла, все, что вам нужно сделать, это добавить одорант по тем же принципам. Хорошо. Здесь я покажу, как подготовить личинок к выслеживанию.

Обычно мы используем личинок возрастом шесть дней. Мы делаем это, потому что они достаточно большие, чтобы их легко обнаружить с помощью нашего программного обеспечения, и они также все еще очень активны, чтобы определить, не слишком ли стары ваши личинки для использования в отслеживании, вам просто нужно проверить, есть ли личинки, карабкающиеся по стенам. Если есть личинки, карабкающиеся вверх по стене, значит, они слишком старые и не будут особенно активны.

Первым шагом в подготовке личинок является погружение их в 15% сахарозы. Причина, по которой мы используем 15% сахарозы, заключается в том, что в этом растворе личинки будут Бойда, а пища вместо этого либо частично растворится в нем, либо опустится на дно. Вы наливаете столько сахарозы, чтобы она находилась, я знаю, чуть меньше чем в дюйме от верхней части вашей бутылки или флакона.

Затем вы берете шпатель. Вы уже можете видеть, как личинки всплывают вверх, и вы осторожно копаетесь в пище, чтобы вытеснить любых животных, которые копаются в пище, немного поворачиваете ее, чтобы отделить их от еды, а затем просто садитесь на пару минут. После того, как пища и личинки будут должным образом отделены, возьмите предварительно маркированную чашку Петри и вылейте их в часть для бипера.

Держите верхнюю часть чашки Петри, так как вы наполните ее водой и используйте ее в качестве вместилища для отслеживаемых личинок, чтобы вы могли отделить, какие из них вы отслеживали, а какие нет. Теперь, когда вы высыпали личинки в чашку Петри, вам нужно подождать 30 минут, пока они адаптируются к сахарозе и достигнут состояния голодания. Это означает, что они будут лучше вести себя в условиях слежения в течение 30 минут, к которым личинка приспосабливается.

Сахароза – хороший момент для подготовки пластин к отслеживанию. Итак, это вершины 96 луночных пластин. Вы можете купить их отдельно и это решение 3%aros, которое уже было прогрето.

Мы используем 3%, потому что он предотвращает рытье личинок, но он также достаточно плотный, чтобы они могли ходить по нему и оставаться увлажненными на каждой вершине пластины. Вы хотите пипеткой 25 мил агроса. Важно стараться избегать образования крупных пузырьков в геле.

Также важно размещать пластины на ровной поверхности, иначе вы можете вызвать гели, которые находятся на склоне и могут повлиять на поведение личинок. После того, как арос застынет, мы складываем верхушки и заворачиваем их в соранскую пленку, чтобы предотвратить их высыхание. Это должно сохранить их в хорошем состоянии для отслеживания в течение нескольких дней.

В этой последовательности я представлю вам наш поведенческий анализ, который немного отличается от анализа на бензиновой тарелке, о котором я рассказывал ранее. Вам понадобятся выводы из 96 луночных планшетов, а также те, которые содержат агрослой. Проба состоит из трех крышек, которые складываются в кучу.

Первая кромка ничего не содержит, пуста и используется только для изоляции системы от поверхности, на которой она лежит. Второй слой содержит агроповерхность Диего. Здесь животные будут размещены на поверхности, и теперь, как я покажу вам далее, мы вводим теодор в тарелку.

Важно использовать свежую и новую крышку каждый раз, когда вы загружаете теодор. Это необходимо для того, чтобы предотвратить любое загрязнение от одного эксперимента к другому. Вам также понадобятся другие разбавления.

Обычно мы не используем краситель для загрузки теодора, но здесь я воспользуюсь им ради иллюстрации. Это высокая концентрация теодора. Хотя этот вариант очень разбавлен, моей целью будет создание градиента вдоль линии.

Произнесите эту линию, и мы хотим, чтобы концентрация увеличивалась слева направо. Для этого я буду использовать несколько капель порядка, помещенных в конденсационное кольцо с возрастающей концентрацией. Я начинаю с самой высокой концентрации, которая будет размещена на конце

Важно разогнать его в ринге. Теперь я приступаю к следующей концентрации, которая разбавляется в два раза по сравнению с первой, и помещаю ее в это кольцо. Так что нет, у меня шесть капель.

Первый содержит концентрацию, скажем, единицы. У второго концентрация 0,5, в два раза меньше первого. Третий – концентрация, 0,25 и так далее.

Таким образом, мы имеем геометрический ряд вдоль линии. Следующий шаг состоит в том, чтобы перевернуть эту крышку на поверхности AAL, и теперь за счет поверхностного натяжения все капли остаются подвешенными в верхней части крышки. Мы разрабатываем метод, основанный на инфракрасной спектроскопии, для измерения всей концентрации в пластине.

Применяя эту технику, мы смогли показать, что если у вас есть геометрический ряд вдоль линии дезодоранта, вы получаете концентрацию теодора по длине, которая увеличивается экспоненциально, как показано здесь, и по ширине пластины. У нас есть профиль, который достигал пика прямо под линией одоранта. Вот как выглядит реальная геометрия градиента.

Если учесть концентрацию теодора в воздухе, то хорошо то, что мы смогли показать, что градиент его геометрии стабилен в течение как минимум 15 минут. После установки верхней крышки мы ждем 30 секунд, чтобы градиент установился. Затем мы выводим животное на арену.

Животное вводится под другую торцевую линию между третьим и четвертым положением, с помощью небольшого штифта переносим личинки из раствора сахарозы на агроповерхность. Пересадка производится путем вылова личинки вокруг головки ногтя. Быстро открываем крышку, личинка откладывается на поверхности агарро.

Затем закрываем крышкой. Важно свести к минимуму время, в течение которого крышка остается открытой. Затем вы записываете движение животного в течение трех или пяти минут.

Производится фактическая запись. С такой настройкой слежения у нас есть камера, которая подключена к компьютеру. Программное обеспечение для отслеживания изображений, которое мы используем, — это Aton vision от Nordis для сбора информации о движении животного и сохранения ее в виде цифрового файла.

Теперь мы собираемся начать поведенческий эксперимент. У нас есть крышка со слоем aro. У нас есть разбавления.

Диего застревает на первой крышке. Перед загрузкой теодора важно провести вихревую обработку каждого флакона. Мы используем наше разбавление с самым маленьким слева и самым высоким здесь справа.

Все шесть капель будут загружены на пластину одновременно. Чтобы избежать потери запаха, мы используем здесь многоканальный пипетер с шестью погружениями, 10 микролитров запаха берется из каждого образца разбавления, и в то же время загружается теодор. При загрузке крышка теперь переворачивается на поверхности агроса.

Градиент был создан на пластине за последние 30 секунд, как я показал вам ранее. Теперь я собираюсь представить животное на поверхности Диего. Как только животное было представлено, я начинаю запись.

Животное находится здесь, и его движение теперь отслеживается. Как вы можете видеть, животное следует за линией одоранта и направляется к самой высокой точке концентрации градиента. Помните, что концентрация увеличивается слева направо с экспоненциальной формой.

Как видите, направление движения постоянно корректируется. Что касается стимула, то теперь животное достигло наивысшей точки концентрации градиента, и мы удаляем его из тарелки. Животное выбрасывается на другую тарелку, чтобы убедиться, что мы не отслеживаем одну и ту же особь дважды напрямую.

После того, как мы вводим новую личинку и начинаем новую запись, вот правила, которым мы следуем для отслеживания. Мы прекращаем слежение, как только животное достигло наивысшего концентрационного ряда пластины, которые соответствуют этому, вот этому. Кроме того, если животное ударяется о стену, слежение прерывается, потому что мы хотим избежать каких-либо помех.

Первый вопрос, который мы рассмотрели, был справедливо «может». Мы хотели узнать, может ли животное чувствовать запах теодора в определенной концентрации. Чтобы провести такой тест, мы обычно имеем один источник запаха вместо нескольких.

Это позволяет иметь одну степень свободы в изменении концентрации в конце капли. Например, здесь у вас есть капля с высокой концентрацией, а здесь — с каплей с низкой концентрацией. Обычно мы помещаем животное на поверхность Диего прямо под каплю Теодора и смотрим, способно ли животное обнаружить его присутствие и остаться в его районе.

Теперь я хотел бы более подробно использовать наш анализ. Представьте, что у вас есть одна капля порядка, и вы записываете несколько траекторий, которые накладываются друг на друга, и у вас их три. У вас есть одна особь, которая генерирует эту зеленую дорожку.

У вас есть оранжевая дорожка, которая находится менее в центре, а затем у вас есть розовая траектория, которая представляет собой животное, которое, по-видимому, вращается вокруг источника. Мы полагаем, что у нас есть много информации о деталях траекторий. По этой причине мы импортируем траекторию в виде серии владения в matlab и выполняем анализ после анализа с помощью matlab.

Вот расстояние до источника, вероятно, в зависимости от времени. Для трех траекторий, которые были показаны ранее, у вас есть зеленая траектория, которая остается очень близкой к источнику. У вас есть оранжевая траектория, которая отображает значительно больше шума.

И вот эта фиолетовая траектория, которая интересно показала, что животное покинуло источник, чтобы остаться на расстоянии, что, вероятно, соответствовало оптимальной концентрации. Здесь вы видите иллюстрацию 10 траекторий, животные, которые не могут чувствовать запахи. Это мутанты или три В-мутанта, которые не являются эллами.

И, как видите, все эти траектории иллюстрируют, что животные не смогли обнаружить источник запаха и просто покинули его. Теперь, в качестве звездного контраста, мы зафиксировали здесь 10 последовательных траекторий для белых водоотводящих животных. Эти животные, конечно же, умеют чувствовать запахи, и, как видите, все они скапливаются прямо под источником дезодоранта.

20 траекторий, которые только что представлены, на самом деле были приобретены, не зная личности животных. Это демонстрирует эффективность и надежность нашего анализа. Определяя, способны ли некоторые мутанты чувствовать запахи здесь с помощью экспоненциального градиента, мы генерируем несколько следов и хотим понять, насколько хорошо животные способны следовать за другим концом стимула.

Итак, я покажу вам 15 траекторий, записанных отдельно, и, как вы можете видеть, животные отлично справляются со своей задачей, следуя за стимулом под другой конечной линией. Теперь перейдем к простому управлению. Очень может быть, что животные в экспоненциальном градиенте следовали за линией, потому что существовал какой-то стимул, независимо от ее концентрации, просто животные шли прямо.

Итак, чтобы показать, что они на самом деле вычисляют концентрацию или что-то, связанное с концентрацией, и используют это для управления своим движением, у нас теперь есть геометрия, которая близка к крыше. Личинка вводится сюда как обычно, и мы ожидаем, что она будет двигаться вдоль линии, а затем обнаружит, что концентрация падает после этой точки, и вернется к ней. Поэтому мы провели тест с пятью животными.

Мы собрали траектории, и теперь представляем их наложенные на этот слайд. И как видите, животные начинали отсюда, двигались по линии, затем исследовали регион, соответствующий наибольшей концентрации и в основном там и оставались. Это убедительно свидетельствует о том, что они способны вычислять другие концентрации в режиме реального времени, используя анализ из одного источника.

Мы смогли задать в основном один большой вопрос. Может ли запах животного обнаружить запах в определенной концентрации с помощью устройства с несколькими источниками? У нас есть больше гибкости в изменении формы градиента и определении того, способно ли животное использовать эту информацию.

Я хотел бы проиллюстрировать эту идею, проведя простой эксперимент. В градиентах, которые мы установили до сих пор, у нас была экспоненциальная форма вдоль линзы. Теперь вопрос в том, что если мы будем больше бросать вызов ал, увеличивая концентрацию линейно вдоль линзы, смогут ли они все еще найти путь под другой конечной линией?

На этом графике представлены два типа градиента. Мы протестировали экспоненциальный в фиолетовом цвете и линейный градиент в зеленом. Это линейный градиент, и я собираюсь записать различные концентрации ацетата исама в разбавляющем пареновом масле.

Это арифметический ряд. У нас есть линейный градиент, который будет устанавливаться, и, как вы можете видеть, наклон довольно пологий по сравнению с экспоненциальным градиентом, где концентрация крайностей также 0,5, но доходит до 0,03. Вопрос в том, способны ли навигаторы противостоять химиоатакам, когда они сталкиваются с таким пологим градиентом?

Здесь указана фактическая концентрация ацетата, используемая в шести каплях для экспоненциального градиента и для линейного градиента. Как вы можете видеть, несмотря на то, что самая высокая концентрация одинакова в обоих случаях для линейного градиента, самая низкая концентрация здесь довольно высока. Мы проводим эксперимент с линейным градиентом, и здесь представлены 15 траекторий дикого типа животных, и мы считаем достаточно очевидным, что эти животные смогли обнаружить линейный градиент и следовать этому сигналу по линии дезодоранта.

Так что, я думаю, наша точка зрения ясна. Прежде чем закончить здесь, я хотел бы кратко рассказать о будущих направлениях этой настройки отслеживания. Хотя эта настройка слежения позволяет делать много интересных вещей, например, наблюдать за сложным поведением личинок в течение более крупного и длительного периода времени, она все же имеет некоторые ограничения.

Например, вы ограничены размером пластины, так что это ограничивает время отслеживания и сложное поведение, которое вы можете просмотреть. Так что было бы неплохо, если бы мы могли разработать систему, в которой либо плита больше, либо вы вообще не ограничены границами плиты. Еще одна проблема заключается в том, что с помощью программного обеспечения, которое у нас есть сейчас, трудно отслеживать более одного животного одновременно, поэтому наблюдать за поведением популяции в режиме реального времени не представляется возможным.

Еще один интересный аспект поведения, который мы не можем проверить с помощью этой установки, — это реальные трехмерные движения личинок в пространстве. Наблюдая за животными, вы увидите, что, например, когда они достигают пахучей капли, они могут поднять голову или повернуть голову, пытаясь обнаружить изменения в концентрации. Возможно, сейчас это невозможно с нашей конкретной установкой, поэтому было бы неплохо разработать что-то, что позволило бы нам это сделать.