Подготовка одноклеточной протеомики к масс-спектрометрическому анализу с использованием лизиса Freeze-Heat и изобарического носителя

SCoPE2 может количественно оценить тысячи белков из тысяч одиночных клеток млекопитающих без антител. Этот протокол может помочь выявить гетерогенность протеома, которая в противном случае была бы невидима для объемного анализа. Одноклеточная протеомика, использующая подход SCoPE2, была разработана, чтобы быть доступной для исследователей с целым рядом ресурсов, от пипетки до робототехники для обработки жидкостей.

SCoPE2 широко применим ко многим областям исследований, включая рак и иммунологию, предоставляя представление о том, как белки различаются в изобилии между отдельными клетками из одной и той же популяции. Чтобы начать процедуру лизиса клеток, поместив 384-луночную пластину с отсортированными одиночными ячейками в термоциклер, нагревая ее в течение 10 минут при 90 градусах Цельсия с последующим охлаждением при 12 градусах Цельсия. Вращайте пластину ненадолго в настольном спиннере при температуре от 18 до 22 градусов по Цельсию.

Обрабатывайте пластину ультразвуком в течение пяти минут на гидроабонизаторе при температуре от 18 до 22 градусов Цельсия. Затем поместите его на лед. Чтобы приступить к перевариванию трипсина, подготовьте 100 микролитров мастер-смеси и добавьте 0,2 микролитра мастер-микса в каждую лунку 384-луночной пластины с помощью жидкого обработчика.

Запечатайте пластину, вихрь в течение пяти секунд и вращайтесь вниз в настольном пластинчатом спиннере при температуре от 18 до 22 градусов по Цельсию. Нагревайте 384-луночную пластину в течение трех часов при 37 градусах Цельсия с температурой крышки, установленной на уровне 52 градусов по Цельсию. Чтобы установить реакцию тандемной массы, возьмите 85 миллимолярных запасов тандемных массовых меток из морозильной камеры при минус 80 градусах Цельсия.

Перед их открытием прогрейте трубки до комнатной температуры и разбавьте этикетки до 22 миллимолей в безводном ацетонитриле. Используя эту стратегию маркировки, добавьте 0,5 микролитра разбавленных тандемных масс-меток в каждую скважину пластины из 384 скважин, используя либо робота для дозирования жидкости, либо ручную пипетку. Запечатайте пластину, вихрь в течение пяти секунд и вращайтесь вниз в настольном пластинчатом спиннере при температуре от 18 до 22 градусов по Цельсию.

Пусть реакция маркировки протекает при температуре от 18 до 22 градусов Цельсия в течение одного часа. Для гашения реакции тандемной массы добавления 0,2 микролитра 0,5% гидроксиламина, разбавленного в воде класса ВЭЖХ, в каждую скважину плиты на 384 скважины с помощью жидкостного обработчика. Запечатайте пластину, вихрь в течение пяти секунд и вращайтесь вниз в настольном пластинчатом спиннере, прежде чем держать пластину при температуре от 18 до 22 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Подготовка анализа LC-MS начинается с удаления комбинированного носителя или эталонного материала из морозильной камеры при минус 80 градусах Цельсия. Для каждого набора, пипетки один микролитр носителя и эталонного материала в первую лунку, будут частью единого набора. Пипетка полного объема от первой скважины до последующей скважины.

Продолжайте пипетку всего объема от одной скважины к другой до тех пор, пока все скважины, включенные в один комплект, не будут объединены в конечную скважину. Для каждого набора добавьте пять микролитров 50% ацетонитрила, разбавленного в воде класса ВЭЖХ, для первого однокалеточного колодца, который будет включен в каждый набор. Пипетка полного объема от первой скважины до последующей скважины.

Продолжайте пипетку всего объема от одной ячейки к другой, пока все скважины, включенные в один набор, не будут объединены в конечную скважину. Теперь перенесите каждый комплект в свои стеклянные вставки автосэмплера. Высушите образцы, как только все наборы будут объединены и помещены в стеклянные вставки.

Перед анализом LC-MS-MS добавьте 1,2 микролитра 0,1% муравьиной кислоты к каждому набору, чтобы повторно суспендировать меченые пептиды. Поместите вставки автосэмплера в стеклянные флаконы автопробоотборника и закройте каждый образец колпачком. Вращайте каждый флакон в течение пяти секунд, чтобы убедиться, что повторное суспендирование завершено, а затем вращайтесь вниз во флаконе при температуре от 18 до 22 градусов по Цельсию.

Убедитесь, что каждый образец находится в нижней части вкладыша, а не разбрызгивается по бокам. Поместите флаконы в лоток автопробоотборника и для каждого набора введите один микролитровый образец для анализа LC-MS-MS. Эффективность пищеварения и маркировки отдельных клеток не может быть напрямую проанализирована, как с носителем, но программное обеспечение DO-MS предоставляет графики, которые оценивают эффективность пищеварения и маркировки.

О плохом пищеварении свидетельствует высокое соотношение интенсивности неправильно расщепленных пептидов к их полностью расщепленным аналогам. Другим фактором, который следует учитывать в наборах, является доля недостающих данных в медианной интенсивности репортерных ионов в каждом тандемном канале массовой маркировки. Когда одиночные клетки успешно подготовлены, недостающие данные на ячейку и положительный контроль намного ниже, чем отрицательные контрольные образцы.

Тщательное обращение с жидкостью во время подготовки образца LC-MS-MS имеет решающее значение для максимального восстановления пептидов. Небольшие образцы из приблизительно 100 пикограмм до 100 нанограммов на лунку могут быть подготовлены для протеомического анализа с использованием изобарического носителя. SCoPE2 делает одноклеточные протеомические измерения доступными для исследователей во всем мире, используя только обычные реагенты и коммерчески доступное оборудование.

Он поддается ручной обработке или высокопроизводительной автоматизации с помощью роботизированной обработки жидкостей.