Подготовка седалищного нерва крысы к нейрофизиологии Ex Vivo

Этот протокол позволяет наблюдать многие нейрофизиологические явления, которые не совсем понятны, такие как перенос нервной блокады после инъекции тока высокой частоты / высокой амплитуды, предотвращая при этом помехи от других процессов в живом организме. Этот метод дает очень воспроизводимые, надежные результаты и является более практичным, чем электрофизиология in vivo, потому что сложные переменные, такие как глубина анестезии, не должны контролироваться и, следовательно, не могут влиять на измерения. После процедуры эвтаназии под анестетиком поместите самку крысы на стол для рассечения, крепко держите лодыжку между большим, указательным и средним пальцами и разрежьте пяточное сухожилие с помощью 12-сантиметровых прямых тупых ножниц.

Используя тонкие щипцы и ножницы, делайте осторожные разрезы через мышечные слои около середины задней части ноги, пока седалищный нерв не будет обнажен. Как только нерв будет виден, увлажните полость, используя ледяной модифицированный буфер Кребса-Хенселейта или MKHB, чтобы предотвратить высыхание нерва. Используя гемостаты, потяните лоскуты кожи с каждой стороны и держите разрез открытым для более тонкого рассечения.

Начиная с места разреза пяточного сухожилия, используя тонкие ножницы, прервите мышцу на медиальной стороне ноги, чтобы освободить нерв. Продолжайте поддерживать уровень влажности в этом районе с помощью ледяного MKHB. Поскольку нерв обнажается при движении вверх по ноге, рассекайте вышележащую мышечную ткань.

Освободите нерв ближе к позвоночнику от соединительных тканей до достижения расщелины позвоночника, после чего возникает перегиб в нерве. Пока не очищайте нерв, так как скорость необходима на этом этапе. Чтобы сделать рассечение легче, используя щипцы, аккуратно потяните конец нерва возле лодыжки.

Затем, используя тонкие ножницы, раздвигает нерв рядом с позвоночником. Поместите рассеченный нерв в 15-миллилитровую центрифужную трубку, заполненную MKHB, и поместите трубку обратно на лед до начала процедуры очистки. Наполните покрытую оболочкой чашку Петри наполовину охлажденным кислородом MKHB, затем поместите один рассеченный седалищный нерв в чашку и прикрепите оба конца нерва к чашке так, чтобы нерв был прямым без перегибов, перекрутов или скручиваний.

Используя 6-0 шелковых швов или тонкую нить, завяжите двойной узел вокруг каждого конца нерва, чтобы предотвратить утечку цитозола в буфер. Поместите узлы рядом со штифтами насекомых сбоку ближе к центру нерва, чтобы предотвратить утечку из нервной ткани в буфер. Под микроскопом, используя двухмиллиметровые угловые пружинные ножницы и тонкие щипцы, удалите жир, кровеносные сосуды и мышечную ткань из нерва.

Обрежьте любые нервные ветви, которые не будут использоваться при стимуляции и записи. После каждых пяти минут очистки заменяйте буфер свежим, охлажденным, насыщенным кислородом MKHB. После очистки поместите нерв обратно в транспортную трубку, заполненную буфером, и положите трубку на лед.

Приготовьте чистую двухкамерную нервную ванну. Используя стандартные лабораторные головки и захваты, поместите нервную ванну ниже уровня двухлитровой бутылки, размещенной на нагревательной мешалке. Подключите слив ванны к входу перистальтического насоса.

Подключите выходное отверстие перистальтического насоса к трубке, ведущей обратно к буферной бутылке. Подключите входное отверстие ванны к трубке с помощью регулируемого клапана потока и поместите трубку внутрь бутылки. Используйте трехсторонний клапан со шприцем, соединенным со средним выпускным отверстием, чтобы помочь с заправкой трубки в качестве сифона для гравитационного буферного притока.

Загрунтуйте сифон, нарисовав шприц до тех пор, пока в него не потечет буфер. Сконфигурируйте клапан таким образом, чтобы скорость буферного потока в ванну составляла пять-шесть миллиметров в минуту. Скорость потока может быть увеличена первоначально для заполнения ванны.

Как только уровень буфера ванны достигнет дренажа, поместите нервы в ванну. Используя штифт насекомого, закрепите конец нерва в углу заполненной буфером ванны камеры. Используя 45-градусные под углом тонкие щипцы и защемляя нерв только на концах, осторожно проденьте нерв, подлежащий стимуляции, через отверстие в перегородке между двумя ванными камерами.

Используя штифт насекомого, закрепите другой конец нерва в масляной камере ванны, гарантируя, что нерв прямой, не растягиваясь и свободный от перегибов и скручиваний. Используя силиконовую смазку, сделайте уплотнение для предотвращения утечки буфера из буферной камеры в масляную камеру Заполните масляную камеру силиконовым или минеральным маслом. Поместите крючки регистрирующих электродов серебра/серебра в камеру масляной ванны и закрепите их с помощью головки босса и захватов.

Затем задрапируйте часть нерва в масляной ванне над крючками, не натягивая нерв. Отрегулируйте или отремонтируйте силиконовое жирное уплотнение, если наблюдается какая-либо утечка после перемещения нерва. Подключите эталонный электрод серебра/хлорида серебра к заземлению усилителя и поместите электрод в заполненную буфером камеру ванны, закрепив ее с помощью лабораторного захвата.

После подготовки чистого электрода с манжетой нерва для стимуляции поместите электрод в заполненную буфером камеру ванны. Используя щипцы или тонкий пинцет с тупыми или угловыми кончиками, откройте электрод в ванне, чтобы намочить внутреннюю часть манжеты. Если пузырьки остаются, используйте тонкий шприц, чтобы вытащить буфер из ванны и вытолкнуть пузырьки из манжеты.

С помощью пинцета аккуратно откройте манжету и засуньте ее под нерв. Закройте манжету вокруг нерва, избегая любого перегиба или скручивания нерва. Подключите стимулирующий электрод и электрод возврата тока к стимулятору.

Если в качестве электрода возврата тока используется квадратный платиновый лист, расположите лист подальше от нерва в ванне. Закрепите оба провода электродов скотчем. Подключите выходной сигнал стимулятора TTL к четвертому каналу осциллографа.

На экране осциллографа нажмите вкладку Триггерный канал и укажите четвертый канал в качестве триггерного канала. Установите уровень триггера на один вольт с помощью ручки уровня. На осциллографе установите временное разрешение на одну миллисекунду на деление и разрешение напряжения на 10 милливольт на деление.

Центрируйте ссылку на триггер во времени и установите уровень триггера на один вольт. После подключения стимулятора к компьютеру включите стимулятор, подключив к входу питания аккумуляторную батарею. Затем запустите программное обеспечение MATLAB на компьютере.

Выполните пользовательский скрипт MATLAB. Затем откройте указанный скрипт MATLAB. Отредактируйте скрипт и установите параметры стимулятора амплитуды импульса до минус 300 микроампер, стимулятора шириной импульса до 300 микросекунд, стимулятора с числом импульсов до 10, а время работы стимулятора между импульсами до одной секунды.

Запустите протокол стимуляции, нажав кнопку Выполнить в программном обеспечении. Потенциал действия соединения, или CAP, имел амплитуду от пика до пика в один милливольт на электроде и 100 милливольт при усилении. Типичная нервная возбудимость для стандартных платиновых нервных манжет и изготовленных на заказ проводящих эластомерных нервных манжет показана здесь.

ЗДЕСЬ показана CAP, полученная ex vivo за день экспериментов с использованием обоих седалищных нервов. Минимальное снижение амплитуды CAP наблюдалось с правым седалищным нервом. Напротив, амплитуда CAP левого седалищного нерва примерно в три милливольта была аналогична амплитуде правого седалищного нерва в начале эксперимента более чем через шесть часов после извлечения нерва.

Подчеркните точность и повторяемость в технике вскрытия, очистки и реализации. Обратите внимание на то, что происходит в бане. Если нервный сигнал теряется, это может быть просто потому, что электроды не находятся в хорошем контакте или что в перегородке масла для ванны есть физиологический раствор, а не то, что нерв погиб.

В первый раз у пользователей может возникнуть соблазн поторопиться, особенно во время фазы рассечения. Это, скорее всего, приведет к ошибкам и повредит нерв. Точность и последовательность являются ключевыми здесь и приведут к более качественным результатам.

Особое внимание следует также уделять последовательности в подготовке буфера.