Удаленный сбор данных криоэлектронной томографии и усреднение субтомограмм
July 12th, 2022
Настоящий протокол описывает удаленный сбор данных криоэлектронной томографии высокого разрешения с использованием Tomo5 и последующую обработку данных и усреднение субтомограмм с использованием emClarity. Апоферритин используется в качестве примера для иллюстрации подробных пошаговых процессов для достижения крио-ET структуры с разрешением 2,86 Å.
Этот протокол обеспечивает легкий доступ в все более популярный, но сложный мир криоэлектронной томографии. Шесть клеточных образцов могут быть визуализированы. Институт в близком к родном штату.
Затем микромолекулы могут быть разрешены с высоким разрешением в их родной клеточной среде с использованием усреднения CROW, ET и субатомов. Начните с запуска программного обеспечения Tomo five с пк сервера TEM. Начните настройку сеанса, настроив параметры получения изображения на вкладке подготовки в разделе настроек.
Скопируйте параметры получения изображения во все остальные пресеты высокого увеличения. Нажмите Set", чтобы установить экспозицию микроскопа, и Get", чтобы получить настройки экспозиции для всех других высоких увеличений после их индивидуального выбора. Чтобы собрать атлас, нажмите на вкладку «Новая сессия» во вкладке «Атлас».
Задайте настройки сеанса. Введите путь к хранилищу и выходной формат и нажмите кнопку «Применить». Выберите «Скрининг» и отметьте все атласы, которые будут получены.
Выберите «Закрыть клапаны вызова»Если микроскоп находится без присмотра, это закроет клапаны колонны. Затем, чтобы начать показ, нажмите кнопку запуска. Проверьте один или несколько атласов на предмет целей, щелкнув по сетке на левой панели в разделе «Настройка сеанса»Затем щелкните левой кнопкой мыши и перетащите мышь, чтобы перемещаться, и среднюю прокрутку, чтобы увеличить и уменьшить масштаб.
Выберите сетку для целевой установки. Выберите его и нажмите «Загрузить образец» внутри программного обеспечения. Чтобы выполнить калибровку сдвига изображения, на вкладке «Автофункции» установите для шаблона настроек «Высота эйцентрика» «Перейти к автоевцентрическому» по наклону ступени и нажмите кнопку «Пуск».
Если объект оставался центрированным во время таргетинга, пропустите калибровку сдвига изображения. В противном случае перейдите на вкладку «Подготовка» для калибровки сдвига изображения выберите «Откалибровать сдвиг изображения» и нажмите «Пуск». Это приведет к выравниванию более низких увеличений с объектом, центрированным на увеличении экспозиции.
Для настройки томографии начните новый сеанс в Session Setup" для биологических образцов. Выберите Slab like"в качестве типа образца и выберите Batch" и Low Dose"Затем выберите выходной формат и папку "storage". При необходимости добавьте получателя электронной почты и нажмите Применить"Чтобы настроить цели, перейдите к стрелке атласа, найдите интересующую область и переместите ее, выбрав параметры, которые появляются при щелчке правой кнопкой мыши.
Сделайте обзорное изображение, чтобы подтвердить хорошее положение для регулировки высоты Эйцентрика. Затем нажмите «автоэвцентрический», чтобы запустить процедуру наклона эйцентрика по ступеням, повторно приобретите новое обзорное изображение, чтобы обновить высоту эйцентрика. Изучите обзор квадрата или полученную карту поиска.
Перейдите в интересующий регион и нажмите получить поиск. Затем осмотрите изображение поиска, если интересующая область не центрирована, щелкните правой кнопкой мыши в нужном положении и повторите этап «Переместить здесь» и получите изображение. Отрегулируйте фокусировку и области отслеживания.
Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы перетащить области отслеживания и фокусировки. После того, как все параметры установлены, нажмите «Добавить позицию» Для выполнения автоматических функций проверьте настройки для выполнения выравнивания через вкладку «Автоматические функции», перейдя по атласу в область углерода. Доведите эту область до эвцентрической высоты и следуйте порядку выравниваний, как описано в текстовой рукописи.
Далее запустите автоматическое получение вкладки томографии. Выберите плиту Сбора данных и задайте нужные параметры. Настройка параметров сбора данных: шаг наклона, максимальный положительный угол, максимальный отрицательный угол, схема отслеживания.
Затем выберите «Закрыть клапаны колонны» для схемы высоты эйцентрика. Начните с подготовки входных файлов и каталогов. Установите папку проекта в папке Project".
Создайте еще одну новую папку фиксированных стеков и подготовьте входные файлы. Серия Tilt один фиксированный наклон серии 1. Серии XF и Tilt 1.tlt.
Чтобы рассчитать расфокусировку, обновите файл параметров с помощью микроскопа и параметров визуализации. Скопируйте файл параметров в папку проекта. Измените его имя на param_CTF.
M и выполните указанную команду. Затем проверьте результаты оценки CTF. Для каждого стека проверьте выровненные стеки с помощью 3D-мода и убедитесь, что фидуциальные бусины стерты правильно.
Убедитесь в правильности ручной передачи, выполнив указанную команду. Затем проверьте значение расфокусировки и убедитесь, что оно соответствует теоретической оценке CTF. Для определения субрегионов сгенерируйте изгиб томограмму.
В папке проекта выполните указанную команду. Определите границы, выбрав шесть точек Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin и Zmax, чтобы создать один субрегион под папкой bin10, выполните указанную команду. Затем запустите выбор частиц для каждого субрегиона.
Для набора данных апоферритина выполните поиск шаблона в bin six. Измените угол подчеркивания шаблона. Параметры поиска для определения угла, диапазона и интервалов поиска в плоскости или вне плоскости в градусах.
В папке проекта выполните указанную команду. Удалите некорректные частицы с помощью 3D мода под папку. Convmap_wedge_Type2_bin6. Выполните указанную команду.
Затем инициализируйте проект. В папке проекта выполните указанную команду, чтобы создать базу данных для ясности EM, AppoF.mat. Выполните реконструкцию томограммы перед субтомоусреднением и выравниванием для генерации томограмм с коррекцией CTF субрегиона в bin4, выполните указанную команду.
Затем, чтобы выполнить усреднение и выравнивание subtomo, выполните усреднение с помощью CTF скорректированных субтелеграмм, начинающихся с bin4. В папке проекта выполните указанную команду. Продолжайте выполнять выравнивания и выполните команду.
Очистите перекрывающиеся частицы, выполнив указанную команду. Выполните окончательную реконструкцию, объединив два половинных набора данных. В папке проекта выполните указанные команды.
Обзор рабочего процесса томографии для клеточной и молекулярной томографии показан здесь для образцов клеток и ламелей, стратегия сбора данных во многом зависит от образца и цели исследования визуализации. Параметры сбора для нескольких криоэт-исследований показаны здесь. Здесь показаны репрезентативные томограммы молекулярных образцов, таких как апоферритин, тонкие клеточные процессы и фрезерованная пластинка с фокусированным ионным пучком толстого клеточного образца.
Структурный анализ с высоким разрешением может помочь выявить места связывания для мишеней лекарств, а томография и субтомогральное усреднение также помогают разработке вакцины против SARS-CoV-2.
Обзор
Этот протокол описывает подробные шаги для дистанционного сбора и обработки данных высокоразрешающей крио-электронной томографии (крио-ЭТ) с использованием апоферритина в качестве модельной системы. Рабочий процесс достигает разрешения структуры крио-ЭТ 2,86 Å, демонстрируя эффективные методы от сбора данных до усреднения субтомограмм.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Крио-электронная томография
- Структурная биология
- Клеточное образование
Бакграунд
- Введение в методы крио-электронной томографии.
- Важность исследования клеточных образцов в их естественном состоянии.
- Использование апоферритина для методологической иллюстрации.
Использованные методы
- Дистанционный сбор данных с помощью программного обеспечения Tomo5.
- Методы обработки с использованием emClarity для усреднения субтомограмм.
- Высокоразрешающая визуализация в биологических системах.
Основные результаты
- Успешно демонстрируют сбор и обработку данных высокого разрешения.
- Достигают детального изображения апоферритина с значительным разрешением.
- Валидированные методологии для будущих исследований крио-ЭТ.
Выводы
- Это исследование предоставляет системный подход для высокоразрешающей визуализации в структурной биологии.
- Описанные методологии актуальны для развития исследований крио-электронной томографии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Cryo-electron tomography (cryo-ET) with remote data collection and subtomogram averaging enables high-resolution structural analysis of macromolecules in near-native cellular environments. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and accelerating early discovery decisions in biopharma R&D. The integration of robust remote workflows ensures uninterrupted access to advanced imaging infrastructure, supporting portfolio continuity and cross-site collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular complexes in situ, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing native conformations and interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for downstream assay development.
- Supports reproducible, quantitative imaging outputs for screening readiness.
- Enables standardization of sample preparation and imaging parameters across projects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native-state structural fidelity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on structural insights.
Pipeline & Workflow Integration
This remote cryo-ET workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing high-resolution, quantitative structural data accessible from any location.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct molecular visualization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables robust measurement of structural parameters and statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, remote-access imaging capability for multi-program support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables remote, scalable data collection.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and cross-functional advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and data analysis software (Tomo5, emClarity).
- Demands robust IT infrastructure for remote access and data storage.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptation across diverse sample types may require protocol optimization.
- Practical limitations include sample thickness, imaging throughput, and computational resources.
