Удаленный сбор данных криоэлектронной томографии и усреднение субтомограмм
12 июля 2022 г.
Настоящий протокол описывает удаленный сбор данных криоэлектронной томографии высокого разрешения с использованием Tomo5 и последующую обработку данных и усреднение субтомограмм с использованием emClarity. Апоферритин используется в качестве примера для иллюстрации подробных пошаговых процессов для достижения крио-ET структуры с разрешением 2,86 Å.
Этот протокол обеспечивает легкий доступ в все более популярный, но сложный мир криоэлектронной томографии. Шесть клеточных образцов могут быть визуализированы. Институт в близком к родном штату.
Затем микромолекулы могут быть разрешены с высоким разрешением в их родной клеточной среде с использованием усреднения CROW, ET и субатомов. Начните с запуска программного обеспечения Tomo five с пк сервера TEM. Начните настройку сеанса, настроив параметры получения изображения на вкладке подготовки в разделе настроек.
Скопируйте параметры получения изображения во все остальные пресеты высокого увеличения. Нажмите Set", чтобы установить экспозицию микроскопа, и Get", чтобы получить настройки экспозиции для всех других высоких увеличений после их индивидуального выбора. Чтобы собрать атлас, нажмите на вкладку «Новая сессия» во вкладке «Атлас».
Задайте настройки сеанса. Введите путь к хранилищу и выходной формат и нажмите кнопку «Применить». Выберите «Скрининг» и отметьте все атласы, которые будут получены.
Выберите «Закрыть клапаны вызова»Если микроскоп находится без присмотра, это закроет клапаны колонны. Затем, чтобы начать показ, нажмите кнопку запуска. Проверьте один или несколько атласов на предмет целей, щелкнув по сетке на левой панели в разделе «Настройка сеанса»Затем щелкните левой кнопкой мыши и перетащите мышь, чтобы перемещаться, и среднюю прокрутку, чтобы увеличить и уменьшить масштаб.
Выберите сетку для целевой установки. Выберите его и нажмите «Загрузить образец» внутри программного обеспечения. Чтобы выполнить калибровку сдвига изображения, на вкладке «Автофункции» установите для шаблона настроек «Высота эйцентрика» «Перейти к автоевцентрическому» по наклону ступени и нажмите кнопку «Пуск».
Если объект оставался центрированным во время таргетинга, пропустите калибровку сдвига изображения. В противном случае перейдите на вкладку «Подготовка» для калибровки сдвига изображения выберите «Откалибровать сдвиг изображения» и нажмите «Пуск». Это приведет к выравниванию более низких увеличений с объектом, центрированным на увеличении экспозиции.
Для настройки томографии начните новый сеанс в Session Setup" для биологических образцов. Выберите Slab like"в качестве типа образца и выберите Batch" и Low Dose"Затем выберите выходной формат и папку "storage". При необходимости добавьте получателя электронной почты и нажмите Применить"Чтобы настроить цели, перейдите к стрелке атласа, найдите интересующую область и переместите ее, выбрав параметры, которые появляются при щелчке правой кнопкой мыши.
Сделайте обзорное изображение, чтобы подтвердить хорошее положение для регулировки высоты Эйцентрика. Затем нажмите «автоэвцентрический», чтобы запустить процедуру наклона эйцентрика по ступеням, повторно приобретите новое обзорное изображение, чтобы обновить высоту эйцентрика. Изучите обзор квадрата или полученную карту поиска.
Перейдите в интересующий регион и нажмите получить поиск. Затем осмотрите изображение поиска, если интересующая область не центрирована, щелкните правой кнопкой мыши в нужном положении и повторите этап «Переместить здесь» и получите изображение. Отрегулируйте фокусировку и области отслеживания.
Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы перетащить области отслеживания и фокусировки. После того, как все параметры установлены, нажмите «Добавить позицию» Для выполнения автоматических функций проверьте настройки для выполнения выравнивания через вкладку «Автоматические функции», перейдя по атласу в область углерода. Доведите эту область до эвцентрической высоты и следуйте порядку выравниваний, как описано в текстовой рукописи.
Далее запустите автоматическое получение вкладки томографии. Выберите плиту Сбора данных и задайте нужные параметры. Настройка параметров сбора данных: шаг наклона, максимальный положительный угол, максимальный отрицательный угол, схема отслеживания.
Затем выберите «Закрыть клапаны колонны» для схемы высоты эйцентрика. Начните с подготовки входных файлов и каталогов. Установите папку проекта в папке Project".
Создайте еще одну новую папку фиксированных стеков и подготовьте входные файлы. Серия Tilt один фиксированный наклон серии 1. Серии XF и Tilt 1.tlt.
Чтобы рассчитать расфокусировку, обновите файл параметров с помощью микроскопа и параметров визуализации. Скопируйте файл параметров в папку проекта. Измените его имя на param_CTF.
M и выполните указанную команду. Затем проверьте результаты оценки CTF. Для каждого стека проверьте выровненные стеки с помощью 3D-мода и убедитесь, что фидуциальные бусины стерты правильно.
Убедитесь в правильности ручной передачи, выполнив указанную команду. Затем проверьте значение расфокусировки и убедитесь, что оно соответствует теоретической оценке CTF. Для определения субрегионов сгенерируйте изгиб томограмму.
В папке проекта выполните указанную команду. Определите границы, выбрав шесть точек Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin и Zmax, чтобы создать один субрегион под папкой bin10, выполните указанную команду. Затем запустите выбор частиц для каждого субрегиона.
Для набора данных апоферритина выполните поиск шаблона в bin six. Измените угол подчеркивания шаблона. Параметры поиска для определения угла, диапазона и интервалов поиска в плоскости или вне плоскости в градусах.
В папке проекта выполните указанную команду. Удалите некорректные частицы с помощью 3D мода под папку. Convmap_wedge_Type2_bin6. Выполните указанную команду.
Затем инициализируйте проект. В папке проекта выполните указанную команду, чтобы создать базу данных для ясности EM, AppoF.mat. Выполните реконструкцию томограммы перед субтомоусреднением и выравниванием для генерации томограмм с коррекцией CTF субрегиона в bin4, выполните указанную команду.
Затем, чтобы выполнить усреднение и выравнивание subtomo, выполните усреднение с помощью CTF скорректированных субтелеграмм, начинающихся с bin4. В папке проекта выполните указанную команду. Продолжайте выполнять выравнивания и выполните команду.
Очистите перекрывающиеся частицы, выполнив указанную команду. Выполните окончательную реконструкцию, объединив два половинных набора данных. В папке проекта выполните указанные команды.
Обзор рабочего процесса томографии для клеточной и молекулярной томографии показан здесь для образцов клеток и ламелей, стратегия сбора данных во многом зависит от образца и цели исследования визуализации. Параметры сбора для нескольких криоэт-исследований показаны здесь. Здесь показаны репрезентативные томограммы молекулярных образцов, таких как апоферритин, тонкие клеточные процессы и фрезерованная пластинка с фокусированным ионным пучком толстого клеточного образца.
Структурный анализ с высоким разрешением может помочь выявить места связывания для мишеней лекарств, а томография и субтомогральное усреднение также помогают разработке вакцины против SARS-CoV-2.
Обзор
В данном протоколе подробно описаны этапы удаленного сбора и обработки данных криоэлектронной томографии (крио-ЭТ) высокого разрешения на примере модельнoй системы апоферритина. Предложенный рабочий процесс позволяет достичь разрешения структуры крио-ЭТ 2.86 Å, демонстрируя эффективные методы от сбора данных до усреднения субтомограмм.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Криоэлектронная томография
- Структурная биология
- Визуализация клеток
Теоретические основы
- Введение в методы криоэлектронной томографии.
- Значимость визуализации клеточных образцов в их нативном состоянии.
- Использование апоферритина для иллюстрации методики.
Используемые методы
- Дистанционный сбор данных с помощью программного обеспечения Tomo5.
- Методы обработки данных с использованием emClarity для усреднения субтомограмм.
- Визуализация биологических систем с высоким разрешением.
Основные результаты
- Успешная демонстрация сбора и обработки данных с высоким разрешением.
- Получение детальных изображений апоферритина с высоким разрешением.
- Валидация методик для будущих исследований методом крио-ЭТ.
Выводы
- Данное исследование представляет собой систематический подход к получению изображений высокого разрешения в структурной биологии.
- Описанные методологии имеют важное значение для развития исследований в области криоэлектронной томографии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Криоэлектронная томография (cryo-ET) с удаленным сбором данных и усреднением субтомограмм позволяет проводить структурный анализ макромолекул с высоким разрешением в условиях, максимально приближенных к естественной клеточной среде. Эта возможность имеет решающее значение для валидации мишеней, снижения технических рисков при изучении механизмов и ускорения принятия решений на ранних этапах открытий в биофармацевтических исследованиях и разработках. Интеграция надежных удаленных рабочих процессов обеспечивает бесперебойный доступ к передовой инфраструктуре визуализации, поддерживая непрерывность работы над портфелем проектов и сотрудничество между различными исследовательскими центрами.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию молекулярных комплексов in situ, что способствует функциональной валидации мишеней.
- Облегчает снижение механистических рисков за счет выявления нативных конформаций и взаимодействий.
- Повышает прогностическую достоверность оценки связывания с мишенью и анализа сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные структурные шаблоны для последующей разработки анализа.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для подготовки к скринингу.
- Позволяет стандартизировать подготовку образцов и параметры визуализации в рамках различных проектов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сочетает визуализацию высокого разрешения с системами, релевантными для заболеваний, для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет сохранения структурной целостности в нативном состоянии.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе структурных данных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный удаленный рабочий процесс крио-ЭТ связывает этапы первичного поиска, идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, предоставляя количественные структурные данные высокого разрешения, доступные из любой локации.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей посредством прямой молекулярной визуализации.
- Скрининг: Предоставляет воспроизводимые количественные результаты визуализации для стандартизации анализа.
- Аналитика: Позволяет проводить надежное измерение структурных параметров и статистическое сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают структурную непрерывность для согласования биомаркеров и моделирования заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает масштабируемую возможность визуализации с удаленным доступом для поддержки нескольких программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует процессы визуализации и позволяет осуществлять удаленный масштабируемый сбор данных.
- Стратегическая ценность: обеспечивает обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и эффективно управляет капиталовложениями в портфель.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и принятию кросс-функциональных решений о дальнейшем продвижении проектов.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области работы с оборудованием для криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и программным обеспечением для анализа данных (Tomo5, emClarity).
- Необходима надежная IT-инфраструктура для удаленного доступа и хранения данных.
- Требуется стандартизация протоколов визуализации и анализа между различными исследовательскими группами.
- Адаптация под различные типы образцов может потребовать оптимизации протокола.
- Практические ограничения включают толщину образца, пропускную способность визуализации и доступные вычислительные ресурсы.
