Флуоресценция РНК in situ гибридизация (FISH) для визуализации микробной колонизации и инфекции в кишечнике Caenorhabditis elegans

Окрашивание РНК FISH полезно для визуализации, идентификации и количественной оценки микробов, которые естественным образом колонизируют или заражают C.elegans, включая бактерии микробиома и внутриклеточные патогены. Этот метод прост, быстр и надежен, что позволяет эффективно окрашивать и визуализировать микробы в контексте целого неповрежденного животного. Мы можем использовать РНК FISH для обнаружения и визуализации бактерий кишечного микробиома в диких C.elegans.

Это может помочь нам понять сопоставимые взаимодействия в системах млекопитающих. После переноса нематод с желаемым микробом, представляющим интерес, от пластин NGM к микроцентрифужным трубкам, промывайте нематод, добавляя один миллилитр 1X PBST в микрофункционные трубки. Вращайте образцы в микроцентрифуге или нанофуге с соответствующей скоростью.

Используя пипетку, удалите все, кроме 100 микролитров супернатанта. Повторите промывку с ПБСТ два-три раза. Чтобы зафиксировать нематоды параформальдегидом, начните с добавления 33 микролитров 16%-ного параформальдегида в микрофьюжную трубку, содержащую 100 микролитров супернатанта над гранулой нематоды для конечной концентрации 4% параформальдегида.

Инкубируйте образцы, содержащие нематод, колонизированных или инфицированных интересующим микробом, в течение 30-45 минут при комнатной температуре. Удалите раствор параформальдегида и добавьте к образцам 0,5 миллилитра PBST. Вращайте образцы в микроцентрифуге с соответствующей скоростью, как указано в текстовой рукописи.

С помощью пипетки удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу. Добавьте 0,5 миллилитра PBST к образцам в микрофьюжных трубках. Повторите промывку с ПБСТ два-три раза.

После последней промывки открутите образцы и удалите супернатант, оставив гранулу нетронутой. Затем подготовьте один миллилитр буфера гибридизации на образец. Добавьте 800 микролитров буфера гибридизации к микрофьюж-трубкам, содержащим гранулу нематоды.

Гранулируйте образцы в микроцентрифуге. Удалите супернатант, не нарушая гранулу. Подготовьте 100 микролитров на образец буфера гибридизации с желаемым зондом FISH до конечной концентрации от 5 до 10 нанограммов на микролитр зонда и вихря для смешивания.

Добавьте 100 микролитров буфера гибридизации, содержащего зонд FISH, к каждому образцу. Перемешайте, осторожно щелкнув или перевернув трубки. Инкубируйте образцы в течение ночи в сухой ванне при температуре от 46 до 54 градусов Цельсия или в термомешалке при температуре от 46 до 54 градусов Цельсия при 1 200 оборотах в минуту.

Подготовьте три миллилитра промывочного буфера на образец. Центрифугирование образцов с соответствующей скоростью. Удалите буфер гибридизации с помощью пипетки, стараясь оставить гранулу нематоды нетронутой.

Добавьте один миллилитр подготовленного промывочного буфера к каждому образцу. Центрифугирование образцов с соответствующей скоростью. Снимите буфер для стирки с помощью пипетки, сохраняя при этом гранулу без помех.

Добавьте один миллилитр подготовленного промывочного буфера к каждому образцу. Инкубируйте образцы в течение одного часа при температуре от 48 до 56 градусов Цельсия в сухой ванне или термомешателе при температуре от 48 до 56 градусов Цельсия при 1 200 оборотах в минуту. При инкубации в сухой ванне осторожно переворачивайте трубки каждые 15-20 минут.

Центрифугирование образцов с соответствующей скоростью. Используя пипетку, снимите буфер для стирки, стараясь оставить гранулу нетронутой. Добавьте от 100 до 500 микролитров PBST к каждому из образцов.

На этом этапе образцы могут храниться в PBST при четырех градусах Цельсия в течение недели, пока протокол не будет готов к продолжению. Гранулируйте образцы с соответствующей скоростью. Удалите как можно больше PBST, не нарушая гранулу нематоды.

Добавьте к образцам 20 микролитров монтажной среды против выцветания с DAPI. Загрузите пипетку объемом 20 микролитров с наконечником пипетки объемом 200 микролитров и используйте ножницы, чтобы отрезать кончик пипетки, чтобы позволить пипетке более крупных нематод. Наконечником нарезанной пипетки переложите от 5 до 10 микролитров гранулы на предметное стекло микроскопа.

Обложка с чехлом 22 на 22. Чтобы сохранить слайды, запечатайте края крышки лаком для ногтей и храните их в темной коробке при четырех градусах Цельсия до готовности к дальнейшему использованию. Под дифференциальным интерференционным контрастным микроскопом было обнаружено, что дикий штамм Caenorhabditis tropicalis колонизирован бактерией, которая, по-видимому, направленно прилипает к кишечному эпителию.

Флуоресцентный сигнал от зеленого универсального зонда 16S рРНК и красного зонда видов альфапротеобактерий полностью перекрывается, предполагая, что большинство бактерий, колонизирующих кишечник, являются прилипшими бактериями альфапротеобактерий. Двудольный геном РНК вируса Орсе состоит из сегментов РНК1 и РНК2, и были разработаны зонды FISH, нацеленные на оба сегмента. Белок ZIP1, помеченный зеленым флуоресцентным белком, локализован в кишечных ядрах клеток, которые показывают положительное окрашивание вируса Orsay FISH в цитоплазме.

Показано, что несколько животных, окрашенных ORSAY-specific или N.parisii-specific FISH, указывают силу этого сигнала для легкой количественной оценки. Совместное заражение C.elegans двумя паразитами microsporidia с использованием видоспецифических зондов, которые конкурируют за связывание с 18S, использование DAPI для окрашивания ядер позволяет лучше локализовать инфекцию в контексте всего животного, особенно для кишечника, который имеет большие, легко идентифицируемые ядра. Инфекции N.parisii приводят к развитию меронтов в споры.

Полученное окрашивание FISH демонстрирует небольшие и крупные палочковидные структуры, которые, вероятно, соответствуют спорам N.parisii, которые окрашены специфическими для N.parisii зондами красного цвета. При выборе фиксирующего средства помните, что фиксация PFA позволяет лучше сохранить морфологию и трансгенный GFP, но фиксация ацетона необходима для визуализации спороплазм. РНК FISH может быть использована для идентификации и визуализации бактерий, колонизирующих кишечник C.elegans.

Затем исследователи могут выполнить больше генетических скринингов, чтобы определить факторы, участвующие в этих взаимодействиях между хозяином и микробом.