Исследование факторов антиревардии в аддиктивном поведении с помощью анатомически специфических методов экспрессии одноклеточных генов
4 августа 2022 г.
Сочетание микродиссекции лазерного захвата и микрофлюидной RT-qPCR обеспечивает анатомическую и биотехническую специфичность при измерении транскриптома в отдельных нейронах и глии. Применение творческих методов с системным биологическим подходом к психиатрическим заболеваниям может привести к прорывам в понимании и лечении, таким как гипотеза нейровоспаления против рвоты при зависимости.
Протокол является высокочувствительным и позволяет захватывать профиль экспрессии генов с высокой пропускной способностью при разрешении одной клетки. Методика обеспечивает как анатомическую пространственную, так и молекулярную специфичность при разрешении одной клетки. После сбора мозга, отбора одиночных клеток и подготовки мРНК, введите жидкость контрольной линии в чип qPCR для прайминга.
Вставьте чип qPCR в микрофлюидное микшерное устройство. Выберите сценарий Prime и запустите программу. После завершения программы извлеките загрунтованный чип qPCR и пипетку шесть микролитров реакции из пластины образца ПЦР в соответствующую пробную скважину в загрунтованной микросхеме qPCR.
Теперь пипетка шесть микролитров реакции из пробирной пластины ПЦР в соответствующую пробирную скважину в загрунтованном чипе qPCR. Затем вставьте чип в микрофлюидное смесительное устройство. Выберите сценарий Load Mix и запустите программу.
Включите микрофлюидную платформу RT-qPCR и разогрейте лампочку. Извлеките чип qPCR из микрофлюидного смесительного устройства и снимите защитную наклейку с нижней части чипа. Откройте микрофлюидную платформу RT-qPCR и загрузите чип qPCR в платформу.
Запустите программное обеспечение для сбора данных, щелкнув Начать новый запуск. Проверьте штрих-код чипа и тип чипа. Затем нажмите «Далее».
Выберите файл запуска чипа и просмотрите расположение файла для хранилища сбора данных. Затем нажмите «Тип приложения» и выберите «Экспрессия генов». Выберите ROX для пассивного эталона, один зонд и EVAGreen для типа зонда.
Нажмите, чтобы выбрать программу термоциклирования и выбрать Biomark HD GE: Fast 96x96 PCR + Melt v2. pcl файл. Загрузите программное обеспечение для анализа данных.
Запустите программное обеспечение для анализа микрофлюидного эксперимента RT-qPCR. Щелкните Запуск чипа и откройте ChipRun. bml-файл, созданный экспериментатором.
Появится окно, отображающее экспериментальные детали, включая пассивный эталон, зонд и тепловизионную программу ПЦР. На вкладке Обозреватель микросхем щелкните Настройка образца пластины и создайте новый образец шаблона пластины. Скопируйте и вставьте образцы этикеток в электронную таблицу программного обеспечения в соответствии с экспериментальным дизайном.
Введите название образца и концентрацию РНК, используемую для стандартных образцов. Теперь сопоставьте пример настройки, щелкнув карта в меню задач и выбрав SBS96-Left.dsp. Затем выберите Представления сведений, чтобы обновить эти изменения в файле, и нажмите кнопку Анализ.
Выберите Настройка детекторной пластины и создайте новую пробирную пластину. Выберите соответствующий тип и формат контейнера. Вставьте имена анализов в соответствии с экспериментальным дизайном и нажмите «Анализировать».
В области параметров анализа щелкните Пользователь и установите для параметра Подгонка значение авто. Теперь вручную просмотрите каждую реакцию в чипе 96x96. Визуализируйте кривые усиления и расплава, чтобы определить, следовала ли каждая реакция ожидаемой схеме qPCR.
Если кривая усиления или расплава не совпадает с ожидаемой, провалите эту реакцию. Следуя контролю качества, экспортируйте данные, выбрав файл, щелкнув экспорт и сохранив набор данных в виде CSV-файла. Поскольку экспортированный CSV-файл имеет как матрицу сбоя передачи, так и матрицу с необработанными значениями CT, используйте матрицу сбоя прохода, чтобы заменить все неисправные ячейки в наборе данных NA. Загрузите последнюю версию программного обеспечения R с открытым исходным кодом, а затем загрузите приложение R Studio.
Для медианного центрирования используйте программное обеспечение R для расчета медианного значения КТ, рассчитанного из всех значений КТ для отдельного образца, а затем вычтите все отдельные значения КТ из этого медианного значения, чтобы получить значение минус дельта КТ. Для нормализации генов домашнего хозяйства рассчитайте среднюю экспрессию генов ведения домашнего хозяйства для каждого образца и используйте это значение для вычитания отдельных значений КТ. Чтобы сгенерировать значение КТ с пониженной дельта-дельтой, запустите код в программном обеспечении R.
Загрузите нормализованный набор данных в R и проанализируйте данные с помощью функции масштабирования, сгенерируйте масштабированные данные, а затем используйте функцию тепловой карты R или отдельное программное обеспечение для создания тепловой карты. Чтобы организовать набор данных для других функций, рассчитайте корреляции Пирсона между каждым геном, за которыми следует функция расплава. Экспортируйте и загрузите эти данные в программное обеспечение сети корреляции генов.
Нейроны показали повышенную экспрессию NeuN, а образцы микроглии показали значительную экспрессию микроглиальных маркеров Cd34 и Cx3xr1. Образцы Th+нейронов продемонстрировали значительно повышенную экспрессию Th по сравнению с образцами Th-нейронов и микроглий. Th-нейроны показали значительную экспрессию Gcg, предполагая, что образцы Th-нейронов обогащены нейронами, которые используют Glp1 в качестве нейротрансмиттера.
Линейный дискриминирующий анализ показал, что эти три типа клеток имели разные профили экспрессии генов во всех 65 генах. Клеточные субфенотипы образцов обогащенных Glp1 нейронов через временной ряд отмены алкоголя были представлены с использованием тепловых карт. Субфенотип А, который высоко экспрессирует воспалительный кластер генов, увеличивается в соотношении в восьмичасовой точке времени отмены и достигает максимума через 32 часа отмены.
Воспалительный субфенотип нормализуется для контроля к 176-часовой отмене. Субфенотип B, который высоко экспрессирует второй кластер генов рецептора ГАМК, демонстрирует общее подавление экспрессии этого кластера генов 176-часовым состоянием отмены. Экспрессия генов отдельных образцов была объединена в средние значения, так что экспрессия кластеров генов и расположение белка этого транскрипта гена могли быть визуализированы на протяжении всего временного ряда.
Этот метод может быть применен к любой биологической системе или ткани, чтобы понять клеточный ответ на болезнь или возмущение. То есть расшифровать молекулярный ответ при разрешении одной клетки, относящийся к пространственной и анатомической архитектуре ткани.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании используются лазерная микродиссекция и микрофлюидная RT-qPCR для анализа транскриптомов отдельных нейронов и глии. Особое внимание уделяется высокой чувствительности и специфичности метода, которые могут расширить наше понимание психических заболеваний, связанных с нейровоспалением, особенно в контексте зависимости.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Транскрипционный анализ
- Психические расстройства
Теоретическая часть
- Понимание паттернов экспрессии РНК в нейронах и глиальных клетках имеет решающее значение для выяснения механизмов психических заболеваний.
- Предыдущим методам не хватало как анатомической пространственной, так и молекулярной специфичности.
- Нейровоспаление было implicated в гипотезу антивознаграждения при зависимости.
Цель исследования
- Разработать высокочувствительный метод регистрации профилей экспрессии генов с разрешением на уровне отдельных клеток.
- Проанализировать связь этих молекулярных изменений с поведенческими реакциями при психических расстройствах.
- Оценить роль нейровоспаления в механизмах формирования зависимости.
Используемые методы
- Был использован микрофлюидный RT-qPCR, что позволило обеспечить высокопроизводительный сбор данных из отдельных клеток.
- Для подготовки и анализа мРНК из тканей головного мозга после забора были изолированы отдельные клетки.
- Были внедрены подробные протоколы прайминга чипа, сбора и анализа данных.
- Данные об экспрессии генов были валидированы и проанализированы с помощью статистического программного обеспечения.
Основные результаты
- В нейронах наблюдалась повышенная экспрессия NeuN, в то время как в микроглии отмечалась значительная экспрессия Cd34 и Cx3xr1.
- На основе профилей экспрессии генов были идентифицированы различные подтипы, в частности, в ответ на синдром отмены и нейровоспаление.
- На основании анализа тепловых карт были сделаны основные выводы о генных кластерах и их регуляции во время стресса, вызванного синдромом отмены.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует, что сочетание этих методологий позволяет более глубоко понять специфические для разных типов клеток реакции на нейровоспаление.
- Полученные данные могут помочь в разработке таргетных терапевтических подходов для лечения психических расстройств, связанных с зависимостями.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Профилирование экспрессии генов на уровне отдельных клеток с анатомической специфичностью позволяет снизить механистические риски при поиске мишеней для терапии нейропсихиатрических расстройств, особенно в отношении путей зависимости и антивознаграждения. Данный подход обеспечивает детальное понимание факторов нейровоспаления, что повышает прогностическую достоверность на пересечении молекулярной патологии и поведенческих фенотипов. Интеграция этих методов в ранние этапы поиска мишеней улучшает отбор проектов в портфеле и обеспечивает трансляционную преемственность при разработке препаратов для ЦНС.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проверить гипотезы о нейровоспалении и системе антивознаграждения с разрешением на уровне отдельных клеток.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем установления связи между экспрессией генов, анатомической и фенотипической специфичностью.
- Способствует механистическому снижению рисков для мишеней ЦНС, вовлеченных в развитие зависимости и синдрома отмены.
- Повышает прогностическую достоверность при продвижении нейропсихиатрических мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных клеточных систем для последующего транскриптомного и фенотипического скрининга.
- Получение количественных, воспроизводимых данных об экспрессии генов для стандартизации анализа.
- Обеспечение высокопроизводительного анализа генных сетей в определенных типах клеток.
- Обеспечение надежной оценки влияния соединений на нейровоспалительные пути.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет молекулярные данные с соответствующими патологии нейроанатомическими системами в моделях аддикции.
- Обеспечивает преемственность этапов от первоначального обнаружения до доклинической валидации нейровоспалительных биомаркеров.
- Служит основой для принятия решений о продвижении программ терапии ЦНС с учетом оценки рисков.
- Ускоряет разработку трансляционных биомаркеров путем картирования экспрессии генов в соответствии с фенотипами синдрома отмены.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод связывает этап первоначального поиска и доклинические исследования, обеспечивая высокопроизводительный и анатомически точный анализ экспрессии генов в тканях ЦНС.
- Открывательная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей развития нейровоспаления и механизмов антивознаграждения.
- Скрининг: Предоставляет воспроизводимые количественные данные об экспрессии генов для разработки анализов и скрининга соединений.
- Аналитика: Позволяет создавать масштабируемые наборы данных для сетевого анализа, построения тепловых карт и статистического сравнения клеточных фенотипов.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярные сигнатуры с состояниями абстиненции, имеющими значение для заболевания, и согласование биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает многократно используемую платформу для транскриптомики единичных клеток в различных моделях ЦНС и заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в ЦНС.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы анализа экспрессии генов на уровне отдельных клеток.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективно управлять капиталом в портфеле нейропсихиатрических исследований и разработок.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению перспективных терапевтических кандидатов для лечения заболеваний ЦНС.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с лазерной микродиссекцией и микрофлюидными платформами для RT-qPCR.
- Необходима развитая аналитическая инфраструктура для высокопроизводительной обработки данных и сетевого анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и нормализации данных.
- Метод адаптируем к различным тканям ЦНС и моделям заболеваний при условии соответствующей оптимизации.
- Эффективность зависит от доступа к специализированному оборудованию и биоинформатической поддержке.
