Расширение понимания микроокружения опухоли с помощью масс-спектрометрической визуализации формалин-фиксированных и парафин-внедренных образцов тканей

В эпоху иммунотерапии рака интерес к выяснению динамики микроокружения опухоли резко возрос. Этот протокол детализирует метод масс-спектрометрической визуализации в отношении его этапов окрашивания и визуализации, которые позволяют проводить пространственный анализ с высокой степенью мультиплексирования.

Эти протоколы позволяют количественно определять разрешение одиночных клеток, коэкспрессию маркеров и специальный анализ с использованием закрепленных формалином и парафиновых и свежезамороженных образцов тканей для выяснения роли иммунных клеток в раке. Данная методика является мощным инструментом, который облегчает одновременную характеристику маркера 40 на одном участке ткани, широко сохраняет структуру ткани в образцах. Критическим этапом является оптимизация и валидация антител.

Неспособность выполнить шаг может привести к низкому качеству изображений, которые могут поставить под угрозу сохранение воспроизводимых данных и результатов высокого качества. Начните с вращения всех антител, содержащих трубки, по 10 000 х Г в течение пяти минут, добавьте отдельные антитела в блокирующий буфер и хорошо перемешайте. Не нарушайте дно трубки антитела при ее пипетке.

Фильтруйте панель антител путем предварительного смачивания 0,1-микрометрового центробежного фильтрующего устройства со 100 микролитрами блокирующего буфера. Раскрутите фильтр при 10 000 x G в течение двух минут и удалите блокирующий буфер с помощью пипетки. Затем переместите панель антител в спиновую колонну и вращайте фильтр при 10 000 x G в течение двух минут.

Отбросьте спиновую колонну и используйте проточную панель в качестве фильтрованной панели антител. Для окрашивания антителом удалите блокирующий буфер со слайдов, опрокинув каждый слайд на бок и осторожно постукивая краями о стеклоочиститель. Поместите слайды во влагоукладку и добавьте в ткань от 100 до 200 микролитров мастер-смеси антител.

Добавьте положительные и отрицательные контрольные слайды в партию окрашивания и высиживайте слайды при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи. Чтобы настроить инструмент, войдите в управляющее программное обеспечение и нажмите «Проснуться», если инструмент находится в спящем режиме. Щелкните Exchange Sample, чтобы загрузить слайд, а затем нажмите «Продолжить», чтобы открыть дверь.

Поместите слайд в загрузочный слот с образцом, обращенным вверх, и этикеткой справа, нажмите «Продолжить», чтобы закрыть дверь. Выберите проект, а затем выберите имя слайда для загруженного образца. Визуализируйте панорамное изображение на панели оптического изображения слайда для поля зрения или выбора FOV, щелкните меню «Режим» и выберите «Вторичный детектор электронов», затем нажмите меню «Режим визуализации» и выберите «QC 300 микрометр».

Нажмите на Jog Stage, чтобы контролировать местоположение FOV, а затем нажмите на стрелки, чтобы перемещаться и выбирать положение FOV. Нажмите «Добавить FOV», установите размер поля «400 микрометр на 400 микрометров» и выберите «Тонкий» в качестве режима обработки изображений и 1 миллисекунду времени ожидания, нажмите «Подтвердить». После создания списка FOV перейдите к фокусировке изображения и отрегулируйте стигматизацию, переместив луч в область ткани, которая не будет отображаться.

Настройте параметры до тех пор, пока не будет получено четкое центральное изображение, нажмите «Начать запуск». Полученные изображения будут автоматически загружены и сохранены в веб-приложении для управления изображениями. Матрица, показанная здесь, описывает процент перекрестных помех, полученных из чистоты зонда и оксидов.

Здесь синие поля указывают больше или равны 0,5% перекрестных помех, а четкие поля указывают менее 0,5% перекрестных помех. Для тегов Mass здесь показаны зонды, которые внесли не менее 0,5% перекрестных помех в отсутствие каналов, один или два канала или более двух каналов. Также показаны массовые каналы, принимающие не менее 0,5% перекрестных помех без зондов, одного или двух зондов или более двух зондов.

Здесь изображены репрезентативные изображения окрашивания в различных тканях, таких как аденокарцинома легких, неопухолевые почки и миндалины. Здесь представлено изображение участка ткани миндалин, окрашенного с использованием этой техники и визуализированного с помощью сторонней программы для анализа цифровых изображений перед фильтрацией и коррекцией. Здесь показано изображение того же раздела в тех же условиях после этапов фильтрации и коррекции.

Этот метод генерирует изображения, которые могут быть загружены в стороннее программное обеспечение для анализа цифровых изображений, что позволяет проводить комплексный анализ, такой как компартментализация тканей, сегментация клеток, коэкспрессия маркеров, а также анализ соседей и удаленный анализ. Методы визуализации с высоким содержанием мультиплекса доступны благодаря исследованиям. Построив различные панели, исследователи могут исследовать раковые, нормальные, паранеопластические, воспалительные и инфекционные образцы.