Личинки данио-рерио как модель для оценки потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов
25 августа 2022 г.
Рыбка данио-рерио недавно использовалась в качестве модели для проверки потенциальных модификаторов радиации. В настоящем протоколе подробно описаны шаги по использованию эмбрионов рыбок данио-рерио для экспериментов по радиационному скринингу, а также некоторые наблюдательные подходы для оценки эффекта различных методов лечения и облучения.
В этом протоколе подробно описаны шаги по использованию эмбрионов рыбок данио-рерио для экспериментов по радиационному скринингу, а также некоторые наблюдательные подходы для оценки лечения различными лекарственными препаратами и радиацией. Это поможет читателям установить полувысокопроизводительный скрининг лекарственных средств, включающий рентгеновское воздействие с использованием эмбрионов рыбок данио, что поможет оценить радиотоксичность и эффективность различных используемых препаратов. Эта процедура может быть использована для скрининга и валидации или оценки различных лекарств в качестве потенциальных радиосенсибилизаторов или протекторов, которые могут быть дополнительно изучены или использованы в области лучевой терапии рака или радиобиологии.
Для начала понаблюдайте за растущими эмбрионами под препарирующим микроскопом. Определите правильную стадию и удалите все мертвые или нездоровые эмбрионы. Обеспечьте адекватную стадию эмбриона, если дозы облучения и лекарства будут введены на определенной стадии гаструляции.
Перед началом эксперимента осторожно распределите здоровые эмбрионы по экспериментальным планшетам с помощью пипетки Пастера. Для каждой экспериментальной группы берут от 15 до 20 эмбрионов. При постановке радиационного эксперимента включите контрольную необлученную и только радиационную группу.
Распределите эмбрионы в планшете лунки, если радиационные экраны могут покрыть и защитить дополнительные лунки от радиации, в то время как другие лунки подвергаются воздействию определенной дозы облучения. В противном случае используйте отдельные пластины или диски, чтобы увидеть эмбрионы за одну дозу облучения. Включите рентгеновский облучатель и запустите инициализацию и прогрев аппарата.
Поместите экспериментальную пластину под облучатель внутри аппарата в центре, убедившись, что пластина находится непосредственно под источником рентгеновского излучения. А затем установить дозу и начать рентген. После завершения облучения выньте пластины, выключите программу аппарата, выключите аппарат и проверьте пластины под микроскопом сразу после облучения.
Удалите мертвые эмбрионы и запишите их количество, оценив их под препарирующим микроскопом. Верните тарелки в инкубатор при температуре 28,5 градусов по Цельсию. Собирайте данные через заранее определенные промежутки времени после проведения облучения.
Запишите все возможные наблюдения, такие как выживаемость, эффективность вылупления, стадия развития, количество сердцебиений, искривление тела и хвоста, отек перикарда, удлинение желточного мешка, микроцефалия, развитие плавательного пузыря, общая моторика или активность и т. д. Чтобы получить изображения, выберите репрезентативные эмбрионы на чистом слайде. Проверьте эмбрионы под микроскопом, сориентируйте их в определенном направлении.
Кривая выживаемости эмбрионов, облученных через шесть часов после оплодотворения, показала, что в контрольной группе и эмбрионах, подвергшихся воздействию 2 и 5 серых, не было выявлено значимой гибели эмбрионов. Количество ударов сердца в минуту показало, что частота сердечных сокращений значительно уменьшалась при увеличении доз рентгеновского излучения. В контрольной группе с каждым 24-часовым интервалом наблюдалось увеличение частоты сердечных сокращений.
Тяжелая сердечно-сосудистая деформация подозревается у эмбрионов, подвергшихся воздействию 15 и 20 грей радиации, поскольку сердцебиение значительно упало. Для эмбрионов, подвергшихся воздействию различных доз радиации в разные моменты времени, выявляются и оцениваются различные фенотипические дефекты и дефекты развития. Также были проведены морфологические наблюдения за искривлением позвоночника или хвоста, пороками развития головы и микроцефалией, дефектами развития, отеком перикарда, деформациями желточного мешка, деформациями плавательного пузыря и изменениями в структуре глаз Для протокола, который мы продемонстрировали, выбор здоровых эмбрионов, правильное размещение эмбрионов в облучателе и правильная оценка перекрестных аномалий являются ключом к этой процедуре.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается использование эмбрионов zebrafish для проведения скрининговых экспериментов на основе облучения. В нем изложены методы наблюдения для оценки эффектов различных видов воздействия и радиации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Радиобиология
- Исследования рака
- Скрининг лекарственных препаратов
Теоретические основы
- Данио-рерио являются ценной моделью для изучения эффектов радиационного воздействия.
- Данный протокол помогает в оценке радиотоксичности и эффективности лекарственных препаратов.
- Он способствует поиску и изучению радиосенсибилизаторов и радиопротекторов.
- Определение стадии развития эмбрионов имеет решающее значение для точного дозирования.
Цель исследования
- Валидация потенциальных модификаторов радиационного воздействия с использованием эмбрионов zebrafish.
- Разработка метода полувысокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов.
- Обеспечение основы для оценки эффективности при лучевой терапии рака.
Используемые методы
- Мониторинг эмбрионов zebrafish под стереомикроскопом.
- Идентификация и удаление нежизнеспособных эмбрионов.
- Введение доз радиации и препаратов на определенных стадиях гаструляции.
- Проведение скрининговых экспериментов для оценки эффектов препаратов.
Основные результаты
- Разработка протокола скрининга лекарственных препаратов на моделях zebrafish.
- Поиск эффективных методов лечения радиотоксичности.
- Валидация потенциальных радиосенсибилизаторов и радиопротекторов.
- Методические рекомендации для будущих исследований в области лучевой терапии рака.
Выводы
- Модель zebrafish эффективна для валидации модификаторов радиационного воздействия.
- Данный протокол может усовершенствовать методики скрининга лекарственных препаратов.
- Полученные результаты могут способствовать прогрессу в лечении рака.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Личинки данио-рерио представляют собой быстрый и масштабируемый In Vivo-платформу для оценки потенциальных радиосенсибилизаторов и радиопротекторов, восполняя критическую потребность в функциональном скрининге на ранних стадиях разработки препаратов для лучевой терапии. Данная модель позволяет проводить количественную оценку радиотоксичности и эффективности препаратов, что повышает прогностическую достоверность и снижает механистические риски на этапе преклинической валидации. Интеграция анализов на базе данио-рерио в процессы поиска новых соединений оптимизирует отбор перспективных кандидатов из портфеля и ускоряет идентификацию многообещающих модификаторов радиационного воздействия для применения в онкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает функциональную валидацию потенциальных радиосенсибилизаторов и радиопротекторов в системе позвоночных.
- Способствует снижению механистических рисков путем установления связи между воздействием препарата и фенотипическими и развивающимися исходами после облучения.
- Облегчает быструю проверку гипотез относительно эффектов модификации радиационного воздействия в контексте целого организма.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает полувысокопроизводительную платформу для скрининга библиотек соединений на наличие радиомодифицирующей активности.
- Позволяет получать воспроизводимые количественные конечные показатели, такие как выживаемость, частота сердечных сокращений и морфологические фенотипы.
- Обеспечивает стандартизированные условия анализа для сравнительного изучения препаратов-кандидатов и контрольных групп.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует клинически значимым конечным точкам за счет моделирования радиационной токсичности и защиты in vivo.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации модификаторов лучевого воздействия.
- Служит основой для принятия решений о продвижении препаратов в портфелях онкологических средств, направленных на усиление радиотерапии, с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный анализ эмбрионов zebrafish служит связующим звеном между этапом первичного поиска и доклинической валидацией, обеспечивая возможность быстрого скрининга и функциональной оценки модификаторов радиационного воздействия перед проведением исследований на млекопитающих.
- Поисковая биология: Обеспечивает проверку нулевой гипотезы относительно модуляции радиационного ответа под воздействием препаратов.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа с воспроизводимыми количественными фенотипическими результатами.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение показателей выживаемости, развития и физиологических конечных точек в различных группах лечения.
- Трансляционные исследования: Моделирует радиотоксичность и радиопротекцию in vivo, имеющую значение для онкологических разработок.
- Корпоративное использование: Предоставляет стандартизированную масштабируемую платформу для повторного скрининга различных наборов соединений.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышение прогностической достоверности и снижение механистической неопределенности при поиске модификаторов лучевой терапии.
- Операционная ценность: обеспечение стандартизированных, воспроизводимых и масштабируемых рабочих процессов скрининга in vivo.
- Стратегическая ценность: оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышение эффективности использования капитала за счет раннего снижения рисков для препаратов-кандидатов.
- Влияние на портфель: поддержка приоритизации и продвижения радиомодифицирующих агентов с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в содержании zebrafish, стадировании эмбрионов и фенотипической оценке.
- Необходим доступ к оборудованию для рентгеновского облучения и инфраструктуре визуализации для проведения конечного анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки анализа, дозирования и критериев оценки.
- Может потребоваться адаптация для конкретных классов соединений или доз облучения.
- Практические ограничения включают ограничения по пропускной способности и необходимость тщательного управления контрольной группой.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:57
Monitoring Embryos and Selection for Radiation Experiments
1:28
X‐Ray Irradiation
2:38
Data Collection, Imaging, and Analysis
3:17
Results: Effect of Different Doses of X‐Ray Irradiation on 6 hpf Zebrafish Embryos
4:23
Conclusion
