Количественная оценка иммуноокрашенной каспазы-9 в ткани сетчатки
25 июля 2022 г.
Здесь представлен подробный протокол иммуногистохимии для идентификации, проверки и нацеливания функционально значимых каспаз в сложных тканях.
Этот протокол обеспечивает подробный иммуногистохимический метод идентификации, проверки и нацеливания функционально значимых каспаз в сложных тканях. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет опрашивать специфические апоптотические и неапоптотические функции каспазы-9 клеточного типа и может применяться к другим сложным тканям и каспазам, представляющим интерес. Понимание функций каспаз может помочь расширить современные знания в области клеточной биологии, а также может быть выгодным для выявления потенциальных терапевтических целей из-за их участия в заболевании.
Начните количественную оценку уровней каспазы, используя конфокальные микроскопические изображения окрашенных участков сетчатки. Для этого перетащите файлы изображений каналов 405, 470, 555 и 640 на консоль Fiji. Щелкните вкладки изображений, цветов и каналов слияния, чтобы назначить цвета файлам.
Затем сожмите стек Z, щелкнув стек изображений и проект Z. Выберите тип проекции как максимальную интенсивность. Откройте интерфейс канала, щелкнув изображение, а затем инструмент цветного канала.
Затем откройте интерфейс яркости и контрастности. Чтобы выбрать параметры для каждого канала, перейдите на вкладку канала и выберите один канал. Поместите курсор поверх фона и аннотируйте значение пикселя.
Затем наведите курсор на ячейку, выраженную в каспасе, и аннотируйте значение пикселя. Чтобы проверить параметры, перейдите в интерфейс яркости и контрастности и нажмите кнопку Выбрать. Подключите минимальное отображаемое значение или значение пикселя ячейки, выраженной в каспазе.
Затем подключите максимальное отображаемое значение или значение фонового пикселя, прежде чем нажать кнопку «ОК». Выберите случайные изображения из слепой ткани и повторите выбор параметров для каждого канала, чтобы проверить параметры для всех каналов. После установки параметров откройте файлы изображений и сожмите стек Z.
Добавьте параметры яркости и контрастности для канала каспазы и изолектина для сосудистого маркерного канала. Используйте точечный инструмент и количественно оцените количество положительных сосудистых областей, используя колокализацию сосудистого маркера с экспрессией каспазы в качестве считывания положительных областей. Затем, используя крючки в качестве маркера положительных нейронных областей, количественно оцените количество положительных сосудистых областей.
Аннотирование значений в электронной таблице для каждого изображения и усреднение значений по разделам. Усредните значения секций, которые будут считываться на глаз. Протокол определил клеточную локализацию каспаз и нейронных слоев сетчатки, в которых экспрессируются каспазы.
Поперечное сечение сетчатки позволило визуализировать ядра сетчатки в ганглиозном слое сетчатки или RGL, межядерном слое или INL, а также внешний ядерный слой или ONL при окрашивании крючками. В поперечном сечении кровеносные сосуды сетчатки оказались разъединенными и раздельными, снабжающими плексиформные слои между RGL и INL и между INL и ONL. Поперечные сечения сетчатки также идентифицировали высокорегулируемую каспазу-9, через день после окклюзии вен сетчатки.
Ингибирование каспазы-9 было более эффективным при снижении экспрессии нейрональной каспазы-7 у нокаутирующих мышей эндотелиальных клеток, что подтвердило функциональную значимость эндотелиальной каспазы-9. Репрезентативный анализ показал, что ингибирование активности каспазы-9 фармакологически блокировало экспрессию каспазы-7 после окклюзии вен сетчатки. Успех метода зависит от тщательной подготовки тканей, а также IHC и микроскопической визуализации для обеспечения согласованности, достоверности и надежности данных.
Этот метод может быть объединен с анализом вестерн-блоттинга для полуколичественного сравнения кассазной сигнализации. Методика обеспечила шаги для опроса эффективности терапевтического подхода, нацеленного на активную каспазу-9 в RVO. Этот подход также может быть применен к другим тканям, включая мозг.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен подробный протокол иммуногистохимического анализа для идентификации, валидации и таргетинга функционально значимых каспаз в сложных тканях. Метод позволяет проводить специфическое изучение апоптотических и неапоптотических функций caspase-9, расширяя представления о биологии клетки и потенциальных терапевтических мишенях при различных заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Патология
Теоретические основы
- Каспазы играют важнейшую роль в апоптозе и различных клеточных функциях.
- Понимание их специфических функций имеет решающее значение для идентификации терапевтических мишеней при заболеваниях.
- Иммуногистохимия обеспечивает детальную визуализацию экспрессии белков в тканях.
- Данное исследование сосредоточено на локализации каспаз, в частности каспазы-9, в слоях сетчатки.
Цель исследования
- Разработать протокол для идентификации и количественного определения экспрессии каспаз.
- Исследовать функциональную значимость каспаз в сложных тканях, в частности, в сетчатке.
- Подтвердить полученные результаты с точки зрения потенциального терапевтического применения.
Используемые методы
- В исследовании используется конфокальная микроскопия для визуализации срезов сетчатки, окрашенных на каспазы и сосудистые маркеры.
- Анализ включает количественное определение уровней каспаз с помощью многоканальной визуализации и компрессии Z-стека.
- Для обеспечения достоверности результатов особое внимание уделяется тщательной подготовке тканей и методам визуализации.
- Предлагаются возможные комбинации с западным иммуноблоттингом для полуколичественной оценки.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет определить специфическую локализацию и экспрессию каспаз в различных слоях сетчатки.
- Ингибирование каспазы-9 оказало значительное влияние на экспрессию каспазы-7 в специфических моделях нокаута.
- Результаты подтверждают функциональную значимость каспазы-9 в контексте окклюзии вен сетчатки.
- Метод подтверждает высокую согласованность и достоверность при сборе данных.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный инструмент для исследования функций каспаз в сложных тканях.
- Полученные результаты способствуют пониманию нейрональных механизмов, участвующих в апоптозе, и возможных способов терапевтического вмешательства.
- Данные, полученные с помощью этого протокола, могут лечь в основу будущих терапевтических стратегий, направленных на пути, связанные с апоптозом.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное иммуноокрашивание каспазы-9 в тканях сетчатки позволяет точно исследовать апоптотические и неапоптотические пути, что способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Данный подход повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и служит основой для принятия взвешенных решений о продвижении проектов в портфелях препаратов для лечения нейродегенеративных и сосудистых заболеваний. Адаптивность данного метода к другим типам тканей делает его универсальным инструментом для программ поиска лекарств при различных показаниях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Обеспечивает функциональную валидацию каспазы-9 как значимой мишени при заболеваниях в нейрональном и сосудистом контекстах.
- Способствует снижению механистических рисков за счет разграничения апоптотической и неапоптотической активности каспазы-9 на уровне типов клеток.
- Облегчает приоритизацию портфеля препаратов, предоставляя количественные доказательства связывания с мишенью и специфичности сигнального пути.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных моделей тканей сетчатки для последующего скрининга соединений и оценки их эффективности.
- Стандартизация иммуногистохимического количественного анализа для получения воспроизводимых количественных результатов в разных экспериментах.
- Обеспечение надежной оценки потенциальных ингибиторов, нацеленных на caspase-9 или родственные пути.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям трансляционного поиска биомаркеров путем картирования локализации caspase-9 в соответствующих слоях сетчатки при данной патологии.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации на моделях окклюзии центральной вены сетчатки и нейродегенерации.
- Обеспечивает прогностическое снижение рисков для терапевтических подходов, направленных на каспаза-опосредованные пути.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол иммуноокрашивания и количественного анализа охватывает все этапы — от начального поиска до доклинических исследований, обеспечивая валидацию мишеней, идентификацию соединений-лидеров и разработку трансляционных биомаркеров.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверять гипотезы о функции caspase-9 и участии соответствующих сигнальных путей в сетчатке и других сложных тканях.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные количественные результаты иммуногистохимического анализа для оценки соединений.
- Аналитика: Предоставляет количественную оценку на основе пикселей и показатели колокализации для достоверного статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: Связывает данные о клеточной локализации с моделями заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров.
- Применение в масштабах предприятия: Адаптивный протокол для различных типов тканей и членов семейства каспаз в рамках программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов при валидации мишени.
- Операционная ценность: способствует стандартизации, воспроизводимости и масштабируемости иммуногистохимических анализов.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет раннего уточнения релевантности мишени.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение программ по нейроваскулярным путям и путям апоптоза.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммуногистохимии, конфокальной микроскопии и количественного анализа изображений.
- Необходим доступ к многоканальному конфокальному микроскопу и программному обеспечению для обработки изображений, такому как Fiji.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров окрашивания, визуализации и количественной оценки.
- Метод может быть адаптирован для других тканей и мишеней каспаз путем оптимизации протокола.
- Достоверность данных зависит от тщательной подготовки тканей и единообразия параметров визуализации.
