Оптимизация ATAC-Seq для исследований эпигенетики рака

ATAC-seq позволяет идентифицировать состояние открытых областей хроматина в геноме, которое часто изменяется в болезненных состояниях по сравнению с нормальным состоянием. Меньший клеточный ввод, упрощенный протокол переваривания Tn5 с последующим выделением фрагментированной ДНК и подготовка библиотеки путем амплификации ПЦР и более короткое экспериментальное время делают его более выгодным методом. Сравнение измененного эпигенетического ландшафта ATAC-seq между нормальными и болезненными состояниями может пролить свет на связанные с заболеванием регуляторные элементы хроматина и быть полезным для разработки новых терапевтических стратегий.

Этот метод прост в выполнении, так как он не включает в себя никаких критических экспериментальных шагов. Чтобы получить успешные результаты ATAC-seq, требуется всего пара шагов стандартизации. Для начала перенесите 25 микролитров из клеточной суспензии, содержащей один миллион клеток на миллилитр в PBS, в 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку и центрифугу при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Осторожно отбросьте супернатант и добавьте 25 микролитров буфера лизиса. Повторно приостановите клетки, осторожно пипетируя вверх и вниз, и высиживайте на льду в течение пяти минут. Центрифугируйте при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и осторожно выбросьте супернатант.

Немедленно повторно суспендируйте гранулу в 25 микролитрах реакционной смеси Tn5 и инкубируйте в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Перемешивайте раствор каждые 10 минут. Добавьте пять микролитров 3-молярного ацетата натрия и 125 микролитров буферного ПБ к меченому раствору ДНК Tn5.

Хорошо перемешать. Затем поместите спиновую колонну в 2-миллилитрную сборную трубку и приложите образец к спиновой колонне. Центрифугу при 17 900 Г в течение одной минуты при комнатной температуре и отбросьте проточную.

Добавьте pe-буфер в столбец и раскрутите столбец. Поместите отжимную колонну обратно в ту же коллекционную трубку и центрифугируйте ее в течение пяти минут, чтобы полностью высушить мембрану. Отбросьте проточную трубу и поместите спиновую колонну в новую 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку.

Элюируйте фрагменты ДНК 10 микролитрами буфера EB, и дайте колонке постоять в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем центрифугируют при 17 900 г в течение одной минуты при комнатной температуре, чтобы элюировать ДНК. Настройте реакцию ПЦР в 200-микролитрных ПЦР-трубках и выполните программу амплификации ПЦР Часть первая.

Для QPCR в режиме реального времени приготовьте реакционную смесь ПЦР, добавив пять микролитров продукта ПЦР, 0,75 микролитра 1 000 разбавленного золота SYBR, пять микролитров 2X PCR Master Mix и 3,75 микролитра воды без нуклеазы. Определите необходимое количество дополнительных циклов ПЦР с помощью параметров запуска. После того, как номер цикла определен, настройте ПКР с дополнительными циклами, рассчитанными ранее.

К усиленным продуктам ПЦР добавляют 150 микролитров бусин и инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре. Поместите трубки на магнитную подставку на пять минут и аккуратно извлеките супернатант. Вымойте бусины 200 микролитрами 80% этанола и удалите супернатант.

Полностью удалите этанол и высушите образцы на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, повторно суспендировать с 50 микролитрами буфера элюирования. Поместите трубку на магнитную подставку, затем перенесите элюат в свежую 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку.

Сравнение эффективности лизиса клеток с использованием трипан-синего цвета показано здесь. Клетки NMuMG обрабатывали гипотоническим буфером и буфером CSK и окрашивали трипановым синим. Более высокая эффективность лизиса клеток наблюдалась в клетках, обработанных CSK.

Библиотеки ATAC-seq были подготовлены из клеток рака молочной железы MDA-MB-231. После амплификации ПЦР продукты ПЦР анализировали на 0,5X TBE, 1,5% агарозном геле до и после очистки шариков. Грунтовки в основном удаляются путем первоначальной очистки бусин.

Также показаны паттерны полосы ДНК от электрофореза 1X TAE 1% агарозного геля и автоматизированного электрофореза. SYBR Gold использовался для визуализации фрагментов ДНК, показанных здесь. Здесь представлен трек браузера генома, показывающий локус ERS1.

На этом рисунке показано покрытие генома данных ATAC-seq в клетках T47D. Были использованы грунтовки из предыдущей публикации, а их целевые области выделены желтым цветом. Здесь показана гистограмма, изображающая обогащение ампликонов грунтовки в библиотеках ATAC-seq.

Библиотеки ATAC-seq были подготовлены гипотоническим буфером или буфером CSK. На репрезентативном изображении показана визуализация генома браузера для оптимизации ATAC-seq. Данные ATAC-seq из 25 000-клеточного входного состояния показали самое высокое обогащение фрагментов без нуклеосом, в то время как входное условие 100 000 клеток представляло собой самые высокие мононуклеосомные ДНК.

Здесь представлены треки браузера генома, показывающие данные ATAC-seq из разных номеров клеток. Анализ пиковой аннотации ГОМЕРА изображен на этом репрезентативном изображении. ГОМЕР классифицировал каждый пик как промоутер проксимального или дистального пика.

Количество входных элементов клеточного буфера лизиса и концентрация фермента Tn5 в зависимости от типа клетки являются наиболее важными параметрами, которые должны быть стандартизированы. Tn5, слитый с белком А в методе cut-and-tack, широко используется для идентификации сайта связывания ДНК для белка, представляющего интерес, с использованием антител, специфичных для этого интересующего белка.