Использование визуализации In Vivo для скрининга фенотипов морфогенеза у мутантных штаммов Candida albicans во время активной инфекции у хозяина млекопитающих

Морфогенез Candida albicans запускается множеством сигналов окружающей среды. Изучая морфогенез in vivo, мы определяем, как организм интегрируется и реагирует на все эти сигналы окружающей среды. Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет изучать морфогенез при отсутствии смещений или артефактов, которые могут быть введены с использованием модельных систем in vitro.

Очень немногие люди имеют опыт внутрикожных инъекций. Я настоятельно рекомендую кому-то, кто новичок в этой технике, связаться с ветеринаром по ресурсам животных для получения помощи в ее изучении. Продемонстрировать процедуру будет Рохан Вакаде, постдокторант из нашей лабораторной группы.

Начните с подготовки животного к прививке, кормя чау без хлорофилла в течение не менее семи дней до прививки. За день до инъекции возьмите кусочек канадских альбиканов из одной колонии с помощью зубочистки. Инокулируют 25 миллилитров YPD и повторяют этот процесс несколько раз, чтобы получить клетки из нескольких разных колоний.

Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия в орбитальном шейкерном инкубаторе при 175 оборотах в минуту. Центрифугировать один миллилитр культуры в течение двух минут при 500 х г, затем трижды промыть дрожжи одним миллилитром стерильного DPBS. Повторно суспендировать гранулу в одном миллилитре стерильного DPBS и разбавить культуру на 1-100.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и соответственно отрегулируйте плотность клеток. Далее создают инокулятив для инъекций, смешивая равные объемы указанного и экспериментального штамма. Используя тампон с ватным наконечником, нанесите безрецептурный крем для депиляции на внутреннюю и внешнюю поверхность обоих ушей обезболенного животного.

Через две-три минуты аккуратно протрите ухо сухой марлей, а затем марлевыми подушечками, насыщенными стерильной водой, чтобы тщательно удалить остатки крема для депиляции. После стерилизации поверхности ушей 70% этанолом хорошо перемешайте инокулятив, перевернув флакон несколько раз или вихря его. Втяните от 20 до 30 микролитров инокулята в инсулиновый шприц.

Держите иглу в вертикальном положении и осторожно постукивайте по шприцу, чтобы убедиться, что любой воздух в стволе находится наверху. Осторожно выбрасывайте воздух и избыток инокулята обратно в инокулятивную трубку или отработанную трубку, чтобы плунжер находился на отметке 10 микролитров. Нанесите безрецептурную двухстороннюю кожную ленту на небольшую коническую пластиковую трубку с круглым дном и задрапируйте ухо поперек ленты, избегая смещения конуса анестезии носа.

Держа шприцевую иглу почти параллельно коже и избегая каких-либо крупных вен, вставьте кончик иглы в самый внешний слой кожи до тех пор, пока скос не будет просто покрыт, и медленно вводите инокулят внутрикожно. Хорошая внутрикожная инъекция поднимет небольшой пузырь в коже. Держите иглу на месте в течение 15-20 секунд, прежде чем вынуть ее из уха, чтобы свести к минимуму утечку.

Следуя институциональным протоколам, пометьте клетку метками биологической опасности, указывающими, что животные в клетке заражены Candida albicans. Используя те же промытые культуры, которые использовались для приготовления инокулята, создают от 1 до 50 разведений клеток в RPMI 1640, дополняют 10% теплом и активируют фетальной бычьей сывороткой и инкубируют при 37 градусах Цельсия с кувырканием в течение четырех часов. Изучите образец с помощью микроскопа.

Подсчитайте не менее 100 клеток, регистрируя количество дрожжевых и нитевидных клеток для каждого штамма. Поверните объектив на большом рабочем расстоянии на место и поместите каплю погружной жидкости на объектив. Опустите объектив, чтобы избежать возможных повреждений при размещении крышки.

Крышка места No 1.5 скользит по отверстию сцены и заклеивает ее на место. Поднимите объектив так, чтобы погружная жидкость контактировала как с объективом, так и с проскальзыванием крышки. Закрепите анестезирующий носовой конус на стадии микроскопа таким образом, чтобы он полностью закрывал нос животного, когда он находится в положении для визуализации.

Поместите нос анестезированной мыши в носовой конус. Поместите каплю стерильной воды на крышку над объективом. Отрегулируйте конус анестезии носа и расположите мышь так, чтобы ухо мыши находилось над каплей воды.

Возьмите еще один скольжение крышки и поместите край крышки параллельно телу мыши, причем край касается мыши там, где ухо встречается с головой. Используя шарнирное движение, опустите свободный край крышки на ступень микроскопа. Когда крышка скользит по ступени микроскопа, она сплющивает ухо.

Лента верхней крышки надежно скользит, чтобы удерживать достаточное давление, чтобы держать ухо плоским и не зацепить волосы мыши или усы в ленте. Если не используется микроскоп с камерой окружающей среды, свободно накройте тело мыши стерильной драпировкой для поддержания нормальной термической среды. Используя белый свет, широкоугольную визуализацию, отрегулируйте плоскость фокусировки в ушной ткани и сосредоточьтесь на красных кровяных клетках, движущихся в кровеносных сосудах.

Чтобы получить достаточно сильное отношение сигнал/шум, чтобы морфологию можно было определить для всех клеток в поле зрения, отрегулируйте мощность лазера или скорость изображения. Чтобы избежать повреждения тканей, используйте минимально возможную мощность лазера. Выберите поле зрения с четким образованием нитей в указанном штамме и где большинство организмов распределены настолько, чтобы можно было определить их морфологию.

Установите верхнюю и нижнюю плоскости фокусировки для Z-стека. Покрытие всей глубины зараженной области не является необходимым, но имейте в виду, что организмы в верхней или нижней части изображенного объема обычно исключаются из анализа. Получайте изображения Z-стека, псевдоцветите каждый канал, чтобы различать каждое напряжение и накладывать каналы.

Сохраните изображения. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для выполнения максимальной проекции Z-стека в двумерное изображение. Подсчитайте каждый организм, видимый на максимальных проекционных изображениях, по типу штамма и морфологии.

Указанный штамм быстро образует нити in vitro. В то время как значение EFG1 Null не смогло сформировать нити. EFG1 Null также демонстрирует значительный дефект филаментации in vivo.

Приблизительно 9% нулевых клеток EFG1 росли в виде нитей in vivo. Аналогичным образом, мутантный штамм CYR1 Null показал дефект филаментации in vitro по сравнению с упомянутым штаммом. Напротив, 53% мутантных клеток CYR1 Null росли как нити in vivo.

Нити, образованные мутантом CYR1 Null, были короче, чем упомянутый штамм. Очень важно держать иглу параллельно коже во время прививки. Цель состоит в том, чтобы поместить инокуляту непосредственно под внешний слой кожи.

Этот метод также может быть использован со штаммами мышей, которые экспрессируют флуоресцентный белок в клетках-хозяевах, представляющих интерес, что позволяет нам изучать взаимодействия патогенов хозяина in vivo.