Экспериментальная количественная оценка взаимодействий между системами доставки лекарств и клетками in vitro: руководство по доклинической наномедицинской оценке

Этот протокол предоставляет количественные данные о том, как системы-носители взаимодействуют с клетками. Количественные данные являются ключевыми для проектирования и оптимизации. Это позволяет нам перейти от биологических вопросов «да» или «нет» к тому, сколько вопросов.

Этот метод полезен для преобразования результатов доклинических показателей носителей лекарств, которые были качественными, в количественные результаты. И это работает, даже когда вы характеризуете своего носителя в другой системе, чем вы характеризуете свои клетки. Может потребоваться несколько итераций, чтобы найти оптимальное разбавление носителей, которые попадают в линейные или количественные диапазоны нано-стороны.

Не торопитесь, чтобы найти правильные условия. Для начала установите проточную ячейку на лазерный модуль. Медленно промывайте проточную ячейку со скоростью 0,1 миллилитра в секунду одним миллилитром дистиллированной воды.

Если пузырьки образуются внутри проточной ячейки, частично втяните суспензию, чтобы объединить пузырь с интерфейсом воздух-жидкость, прежде чем продолжить. Затем зафиксируйте весь лазерный модуль на месте внутри прибора. Запустите камеру примерно на полпути через промывку.

Обязательно подтвердите, что мусор носителя вымыт. Выберите захват, чтобы открыть вкладку настроек захвата, и нажмите кнопку Запустить камеру. Привод системы с помощью одного миллилитра воздуха.

Если на экране видны статические носители, очистите проточную ячейку в соответствии с инструкциями производителя. Подготовьте носители к анализу отслеживания наночастиц, убедившись, что носители хорошо подвешены с помощью ультразвука или вихря, в зависимости от задействованной системы носителей. Разбавляют носители в воде для получения по меньшей мере от 0,6 до одного миллилитра каждого образца с концентрацией носителя от 1x10 до седьмого и от 1x10 до девятого носителя на миллилитр.

Выньте лазерный модуль и поместите его в вертикальное положение. Опустите первый образец носителя в шприц на один миллилитр и прикрепите шприц к входному отверстию трубки. Затем осторожно загрузите образец в проточную ячейку.

Если пузырьки образуются внутри проточной ячейки, частично втяните суспензию, чтобы объединить пузырь с интерфейсом воздух-жидкость, прежде чем продолжить. Убедитесь, что вся проточная ячейка заполнена жидкостью, затем приостановите загрузку. Отрегулируйте фокусировку камеры, если это необходимо, чтобы визуализировать отдельные носители.

Выполняйте грубые настройки фокусировки с помощью вращающейся ручки с правой стороны инструмента. Внесите более точные изменения, выбрав вкладку оборудование. Измените фокус, отрегулировав ползунок фокусировки.

Чтобы убедиться в отсутствии перенасыщения, выберите оптимальный уровень камеры, отрегулировав ползунок на вкладке захвата. Если прибор оснащен этим аксессуаром, загрузите шприц, содержащий образец носителя, в шприцевой насос. На вкладке СОП выберите стандартное измерение, чтобы сделать пять снимков по 30 секунд каждый.

Введите имя базового файла и при желании добавьте дополнительную информацию о примере, нажав кнопку «Дополнительно», которая откроет модальный диалог с различными вариантами. Нажмите создать и запустить сценарий и подождите, пока появится всплывающее окно с просьбой предоставить пример. Если используется шприцевой насос, выберите вкладку оборудования, а затем вкладку шприцевого насоса.

Установите нужную скорость инфузии и настаивайте на прессе. Если не используется шприцевой насос, вручную продвиньте образец. Во всплывающем окне нажмите кнопку ОК, чтобы начать запись.

После каждого из пяти захватов, когда снова появится расширенный образец, убедитесь, что образец все еще движется через проточную ячейку. Затем нажмите кнопку ОК, чтобы продолжить следующий захват. На вкладке «Процесс» настройте ползунок порога обнаружения между четырьмя и восемью, чтобы правильно определить различные носители, видимые на экране.

Вы можете настроить усиление экрана, чтобы облегчить визуализацию, это не повлияет на последующий анализ. Во всплывающем окне нажмите ok, чтобы начать анализ отслеживания. Следите за ходом анализа, нажав на анализ в одной вкладке анализа.

После завершения анализа найдите запрос на экспорт настроек. Убедитесь, что выбран параметр Включить PDF и включить сводку эксперимента. Выберите любые другие форматы экспорта по желанию.

В разделе результатов экспорта данных в формате PDF для обеспечения надежности измеренной концентрации убедитесь, что измеренная концентрация носителя составляет от 1x10 до седьмого и от 1x10 до девятого носителя на миллилитр, и проверьте наличие любых сообщений об ошибках или сообщений с предупреждением под результатом измерения концентрации. Повторите процедуру два или более раз с различными разбавлениями из запаса и убедитесь, что концентрация каждого образца попадает в линейный диапазон прибора. Рассчитайте концентрацию носителей запаса, как описано в тексте рукописи.

Готовят свободный или конъюгированный раствор фторхрома со свободным или антителом, как описано в тексте рукописи. Рассчитайте концентрацию исходного раствора из концентрации, молекулярной массы и числа Авогадро, как показано в уравнении. Затем выполняют последовательное разбавление красителя в разбавителе носителя для получения стандартных образцов кривой.

Затем добавьте образец носителя на измерительную пластину и измерьте флуоресценцию с помощью считывателя микропластин. Сгенерируйте стандартную кривую, как описано в текстовой рукописи. Рассчитать абсолютную интенсивность флуоресценции на носитель путем деления объемной флуоресценции на концентрацию носителя.

Настройте проточный цитометр для окончательного эксперимента с несущей ячейкой, определив оптимальные настройки напряжения PMT в соответствующих каналах. Запустите отрицательный контрольный образец, где клетки не инкубируются с носителями, чтобы определить фоновую флуоресценцию. Подготовьте и повторно приостановите шарики количественного определения проточной цитометрии.

Используйте тот же буфер, что и для образцов ячеек. Если популяции бусин предоставляются отдельно, соберите их вместе. Запустите шарик количественного определения проточной цитометрии и образцы клеток-носителей, чтобы определить интенсивность флуоресценции на клетку.

Запустите шарики количественного определения проточного цитометра для создания стандартной кривой, преобразующей абсолютную интенсивность флуоресценции в MFI. Используйте это для расчета теоретической МФО носителей, как описано в тексте рукописи. Запустите образцы клеточных носителей, чтобы определить интенсивность флуоресценции на клетку каждого образца.

Наконец, рассчитайте количество носителей на ячейку для каждого образца, вычитая фоновую флуоресценцию из измеренной флуоресценции образца, а затем деление на флуоресценцию на частицу. Для частиц ядра полиметакриловой кислоты длиной 633 нанометра концентрация и интенсивность флуоресценции на носитель поддавались непосредственной количественной оценке с использованием потока цитометра. Напротив, 100-нанометровые суперпарамагнитные наночастицы оксида железа были слишком малы для индивидуального обнаружения и анализировались с использованием объемного потока.

Маркированные бусины количественного определения использовались в течение нескольких дней для генерации стандартных кривых на проточном цитометре. Корреляция между измеренной МФО и значением MESF бусин количественного определения была линейной и в целом аналогичной между измеренными датами. Эксперименты с использованием флуоресцентных меченых клеток HeLa с капсулами полиметакриловой кислоты 235 нанометров от нуля до 24 часов показали увеличение MFI с течением времени, что указывает на то, что капсулы ассоциировались с клетками HeLa.

Разница в кажущемся клеточном ответе на носителей была резкой, в зависимости от относительной или абсолютной количественной оценки. Абсолютная количественная оценка не зависела от интенсивности маркировки и, следовательно, была более сопоставимой. Эти методы являются основой для более глубокого анализа и сравнения характеристик частиц.

Мы рады использовать эти методы для параметризации математических моделей, которые позволят нам охарактеризовать производительность частиц независимо от какого-либо конкретного эксперимента.