Флуоресцентный пожизненный макротомограф для биомедицинских применений
7 апреля 2023 г.
В этой статье описывается использование нового быстрого оптического тепловизора для макроскопической фотолюминесцентной визуализации образцов с длительным распадом. Описаны процедуры интеграции, получения и анализа изображений, а также подготовка и характеристика материалов датчиков для визуализации и применения тепловизора при изучении биологических образцов.
Наш протокол обеспечивает подробное 2D-картирование времени жизни фосфоресценции и концентрации кислорода в макроскопических объектах, особенно в тканях живых животных и целых животных, с помощью специальных зондов и сенсорных материалов. Эта информация важна для многих областей исследований. В нашем протоколе используется интегрированный и компактный модуль визуализации, который работает в режиме TCSPC и обеспечивает простую и точную визуализацию времени жизни и распределения кислорода в сложных биологических образцах, таких как живая ткань.
Возьмите адаптер Cricket и осмотрите его с разных сторон. Снимите адаптер C-mount на передней стороне, чтобы показать усилитель Photonis PP0360EF, размещенный в Cricket, а затем вставьте адаптер C-mount обратно. Снимите адаптер C-mount C-mount на передней стороне C-mount и вставьте эмиссионный фильтр 650 плюс/минус 50 нанометров.
Исправьте это, вернув C-mount. Затем подключите модуль камеры TPX с тремя кулачками к задней стороне модуля Cricket через их кольцевые адаптеры. Подключите объектив к передней стороне модуля Cricket через адаптер C-mount.
Подключите светодиод к источнику питания и генератору импульсов. Теперь установите 390-нанометровый сверхяркий светодиод на стойку, прикрепленную к макетной плате внутри черного ящика. Включите светодиод и сфокусируйте его, чтобы обеспечить эффективное и равномерное возбуждение изображаемого образца.
Установите камеру в сборе поверх оптического черного ящика лицом вниз к сцене, на которой будут изображены образцы. Подключите камеру и светодиод к двухимпульсным генераторам и четырехканальному осциллографу. С помощью настроек осциллографа и генераторов импульсов синхронизируйте импульсы, посылаемые на камеру, и светодиод.
Используйте специальный кабель и розетку на блоке Cricket, чтобы подключить усилитель к стандартному источнику питания и установить усиление на 2.7 вольта. Расположите образец перед объективом камеры. Затем включите камеру и все электрические модули, кроме усилителя.
Активируйте программное обеспечение SOFI для настройки рабочих параметров, таких как фокусировка и выравнивание образца. В модулях установите выдержку кадра на 0,01 секунды. Выберите «Бесконечные кадры» и установите режим работы пикселей на превышение порогового значения.
Затем перейдите в «Предварительный просмотр» и выберите «Активный модуль», чтобы открыть окно кадров Medipix / Timepix. На следующем шаге, после начала записи, отрегулируйте цветовую шкалу и поверните изображение в нужную ориентацию. После этого выключите свет в комнате и включите усилитель.
Сфокусируйте оптику камеры на предметном столике образца с помощью возможностей фокусировки объектива и адаптера Cricket для создания четких изображений образцов с хорошей контрастностью и яркостью. После завершения фокусировки закройте программное обеспечение SOFI. Затем перейдите в терминал, выполните команды специально разработанного программного обеспечения, чтобы получить необработанные данные в двоичном формате и закрыть терминал.
Откройте новый терминал для обработки полученных данных. Загрузите файл данных и запустите редуктор данных. Проанализируйте данные постобработки с помощью специальной программы, написанной на языке C, которая запишет данные в файл образа ICS.
Затем откройте файлы изображений ICS с помощью свободно доступного программного обеспечения Time Resolution Imaging и используйте две экспоненциальные функции, чтобы соответствовать распадам фосфоресценции. Наконец, откройте Fitted. ICS image с доступным программным обеспечением для анализа изображений.
Создавайте изображения с пожизненным циклом фосфоресценции с помощью таблиц подстановки и кодируйте их в псевдоцветовой шкале. Используйте функцию «Измерение» для расчета средних значений времени жизни для всего изображения или интересующих областей. Показаны изображения интенсивности фосфоресценции и времени жизни фосфоресценции с помощью микроскопии пятна датчика платинового октаэтилпорфиринового красителя в оксигенированном и дезоксигенированном состояниях.
Убедитесь, что внутри Cricket установлен правильный эмиссионный фильтр и используются правильные светодиоды, кабельные соединения и настройки импульсов. В настоящее время этот протокол ограничен животными моделями, но потенциально может применяться для диагностики и лечения патологических состояний, связанных с гипоксией тканей, таких как рак, инсульт и воспаление.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый оптический имиджер, разработанный для макроскопической визуализации времени жизни фотолюминесценции, что особенно полезно при работе с биологическими образцами, такими как ткани живых животных. Данный протокол позволяет проводить детальное картирование времени жизни фосфоресценции и концентрации кислорода, что имеет решающее значение для понимания различных биологических процессов.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Биологическая визуализация
- Анализ времени жизни фосфоресценции
- Измерение концентрации кислорода
Теоретические основы
- Макроскопическая визуализация необходима для изучения сложных биологических образцов.
- Существующие методы могут быть недостаточно эффективны при анализе образцов с длительным периодом распада.
- Данное исследование направлено на совершенствование методов визуализации в живых тканях.
Используемые методы
- Оптическая визуализация в режиме корреляции одиночных фотонов по времени (TCSPC)
- Применение на живых тканях животных
- Использование специализированных модулей визуализации и программного обеспечения для обработки данных
Основные результаты
- Эффективная визуализация времени жизни и распределения кислорода
- Возможность получения высококонтрастных изображений времени жизни фосфоресценции
- Успешное применение для наблюдения условий гипоксии в тканях
Выводы
- В исследовании представлен инновационный подход к визуализации для биологических исследований.
- Потенциальные возможности применения для диагностики и лечения состояний, связанных с гипоксией тканей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности и прикладного применения
Количественное картирование оксигенации тканей с помощью визуализации времени жизни фосфоресценции отвечает критической потребности доклинических исследований в точной оценке гипоксии. Эта возможность повышает прогностическую достоверность моделирования заболеваний и способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней в онкологических и метаболических исследованиях. Быстрая и высокочувствительная визуализация данной платформы позволяет проводить надежную оценку микроокружения тканей, что помогает в принятии решений по портфелю проектов на ранних стадиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямой анализ оксигенации тканей в качестве функционального биомаркера в моделях заболеваний.
- Способствует снижению механистических рисков, предоставляя данные о гипоксии с пространственным разрешением в живых тканях и тканях ex vivo.
- Облегчает валидацию мишеней путем установления связи между распределением кислорода и активностью биологических путей.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные модели тканей для последующего скрининга соединений в условиях контролируемого уровня оксигенации.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные измерения времени жизни для стандартизации анализа.
- Обеспечивает готовность к высокопроизводительному анализу за счет сокращения времени визуализации до менее чем 20 секунд на образец.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие доклинических моделей сигнатурам гипоксии, характерным для заболевания, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Поддерживает метаболическую визуализацию как в системах ex vivo, так и на живых животных.
- Предоставляет количественные конечные точки для продвижения терапевтических кандидатов с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная платформа визуализации объединяет этапы от ранних открытий до доклинической валидации, поддерживая рабочие процессы валидации мишеней, идентификации соединений-лидеров и трансляционных исследований.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о механизмах, зависящих от кислорода, в моделях тканей.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные количественные показатели для разработки анализа и оценки соединений.
- Аналитика: создает количественные карты времени жизни и концентрации кислорода с пространственным разрешением для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает этапы фундаментальных открытий и доклинических исследований, соотнося результаты визуализации с биомаркерами гипоксии, значимыми для конкретных заболеваний.
- Корпоративное использование: предоставляет модульные, реконфигурируемые возможности визуализации, адаптируемые к различным зондам и тканевым системам.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и устраняет неопределенность механизмов в моделях заболеваний, вызванных гипоксией.
- Операционная ценность: обеспечивает быстрое, воспроизводимое получение изображений с использованием стандартизированных протоколов и гибкой совместимости зондов.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и распределение капитала за счет предоставления надежных количественных конечных точек.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе валидированных данных об оксигенации тканей.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области оптической визуализации и анализа времени жизни фосфоресценции.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию, включая камеры с поддержкой TCSPC и усилители изображения.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов визуализации и рабочих процессов анализа данных.
- Метод может быть адаптирован к различным моделям тканей и химическим зондам при соответствующей конфигурации.
- В настоящее время метод ограничен моделями на животных; применение к другим системам требует дополнительной валидации.
