Флуоресцентный прижизненный подход к визуализации для изучения индуцированной нагрузкой сигнальной динамики кальция в остеоцитах мышей
24 февраля 2023 г.
В настоящей статье описывается применение прижизненной визуализации для наблюдения за механически индуцированной кальциевой сигнализацией встроенных остеоцитов in vivo в режиме реального времени в ответ на механическую нагрузку третьей плюсневой кости мыши на тканевом уровне.
Этот протокол предоставляет способ наблюдения встроенных остеоцитов in vivo, что представляет собой важный шаг вперед в изучении механобиологии костей. Основным преимуществом этого метода является возможность наблюдать за событиями на клеточном и молекулярном уровне в остеоцитах in vivo, сохраняя их естественное трехмерное пространственное расположение, кровоток и эндокринные условия, а также преодолевая ограничения, обычно налагаемые клеточными экспериментами in vitro. Этот метод предназначен для фундаментальных научных исследований на мышиных моделях. Они пока не распространяются на терапию или диагностику, но дают возможность получить понимание, которое определит следующее поколение лечения костей.
[Рассказчик] Для начала сделайте скальпельный разрез через дерму между второй и третьей плюсневыми костями, начиная с дистального конца и продвигаясь проксимально по длине костей. С помощью щипцов откройте операционное место, подтягивая кожу к медиальному или латеральному краям. Резецируйте сухожилия разгибателей с помощью прямых ножниц Ваннаса, чтобы обнажить третью плюсневую кость. Вставьте центральный штифт точки опоры устройства для загрузки плюсневых костей в небольшое пространство на дистальном конце, где третья плюсневая кость встречается с проксимальной фалангой. Затем переместите штифт проксимально до тех пор, пока он не упрется в средний стержень третьей плюсневой кости. Обратите особое внимание на то, чтобы гарантировать прямое соприкосновение между костью и штифтом, исключая любые мышцы и фасции. Зажмите лодыжку щипцами и поместите стопу в водяную баню, наполненную DPBS. Закрепите лапу на месте с помощью загрузочного кронштейна и подсоедините кронштейн к механизму тензодатчика привода. Аккуратно поднимите настройку загрузочного устройства с помощью мыши и поместите ее на платформу микроскопа. Начните с объектива с малым увеличением в режиме эпифлуоресценции, чтобы определить местоположение и центрировать средний диафиз кости. После того, как интересующая область будет найдена, переключитесь на большее увеличение объектива с погружением в воду и переключите оптику на два фотона. Задайте плотность пикселей с помощью настроек управления областью Гальво/Резонанс. Чтобы избежать фотообесцвечивания, уменьшите энергопотребление с помощью опции управления мощностью и увеличьте усиление ФЭУ в настройках управления сканером Galvo/Resonance. Определите поверхность кости в двухфотонном режиме, найдя автофлуоресценцию фиброзной надкостницы в зеленом канале, который использует полосовой фильтр с центром 525 нанометров. Если во время нагружения происходит заметное движение кости, выберите другую область интереса по осям Y или Z, чтобы убедиться, что она находится непосредственно над центральным штифтом точки опоры. Если движение не прекращается, отрегулируйте хирургическое положение штифта вручную под третьей плюсневой костью. Проведите визуализацию стека Z с нагрузкой в соответствии с экспериментальным дизайном для регистрации морфометрических сигнальных событий, а затем визуализацию серии T с нагрузкой для записи сигнальных событий, вызванных динамической нагрузкой. Здесь показано одноплоскостное двухфотонное изображение плюсневых остеоцитов, экспрессирующих GCaMp6f in vivo. Эндогенная экспрессия кальциевых репортерных конструкций обеспечивает флуоресцентную мишень без необходимости инкубации. На рисунке представлена проекция 3D Z остеоцитов in vivo, полученная с помощью двухфотонной микроскопии. Поперечный разрез в плоскости XY и сагиттальный разрез показывают глубину стека Z. На репрезентативном изображении показан пример временного хода флуоресцентного сигнала GCaMp6f от встроенного остеоцита. В состоянии покоя наблюдаются низкоуровневые зашумленные колебания. При нагрузке колебания кальция увеличиваются по величине и регулярности, часто происходя в ногу с приложенной нагрузкой.
Этот метод открывает исследователям путь к ответу на функционально обоснованные вопросы, касающиеся механобиологии остеоцитов in vivo, которые ранее были возможны только in vitro или ex vivo.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол прижизненной визуализации для наблюдения за кальциевой сигнализацией в остеоцитах в ответ на механическую нагрузку in vivo. Этот метод позволяет в режиме реального времени наблюдать за клеточными событиями, сохраняя естественную среду костной ткани.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Механобиология кости
- Методы прижизненной визуализации
- Кальциевая сигнализация в остеоцитах
Теоретические основы
- Остеоциты играют ключевую роль в механобиологии кости.
- Традиционные методы in vitro ограничивают понимание клеточных реакций в их естественной среде.
- Данный метод позволяет наблюдать за остеоцитами, сохраняя их трехмерное пространственное расположение и физиологические условия.
- Полученные данные могут лечь в основу будущих стратегий лечения заболеваний костной ткани.
Цель исследования
- Разработать метод наблюдения за остеоцитами in vivo в процессе механического нагружения.
- Углубить понимание динамики кальциевой сигнализации в остеоцитах.
- Создать основу для дальнейших исследований здоровья костной ткани и заболеваний костей.
Используемые методы
- Разрез скальпелем для доступа к третьей плюсневой кости у мышей.
- Использование устройства для нагрузки на плюсневую кость с целью создания механического стресса.
- Двухфотонная микроскопия для визуализации остеоцитов в режиме реального времени.
- Регистрация сигнальных событий, индуцированных динамической нагрузкой, с помощью Z-стека и T-серийной визуализации.
Основные результаты
- Визуализация в режиме реального времени выявила колебания уровня кальция в остеоцитах в процессе нагрузки.
- Амплитуда флуоресцентных сигналов увеличивалась по мере усиления механического стресса.
- 3D-визуализация позволила получить представление о пространственном расположении остеоцитов.
- Была продемонстрирована эффективность данного метода для изучения механобиологии костной ткани.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает значительный прогресс в изучении механобиологии костной ткани.
- Визуализация остеоцитов в режиме реального времени может способствовать более глубокому пониманию здоровья костей.
- Этот метод может проложить путь к будущим терапевтическим стратегиям лечения заболеваний костей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности и бизнеса
Прямая визуализация кальциевого сигналинга остеоцитов in vivo при механической нагрузке восполняет критический пробел в понимании механотрансдукции костной ткани на молекулярном уровне. Данная возможность повышает прогностическую достоверность на ранних этапах исследований, позволяя наблюдать за механосенсорными путями в режиме реального времени в их естественном физиологическом контексте. Такой подход способствует снижению механистических рисков и предоставляет данные для валидации мишеней при разработке препаратов для поддержания здоровья костей и терапии скелетных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механосенсорные пути остеоцитов в физиологически релевантных условиях.
- Способствует снижению биологических рисков за счет сохранения нативной 3D-архитектуры и системных воздействий.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для механизмов механотрансдукции в костной ткани.
- Повышает прогностическую достоверность при определении приоритетности мишеней, связанных с костной тканью.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную систему in vivo для количественного анализа динамики кальциевой сигнализации в ответ на определенные механические нагрузки.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели активности остеоцитов для последующей разработки анализов.
- Способствует стандартизации анализов механотрансдукции для оценки соединений.
- Закладывает основу для масштабируемого скрининга модуляторов, влияющих на механочувствительность костной ткани.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет механизмы действия с релевантными моделями заболеваний костной ткани для обеспечения трансляционной преемственности.
- Позволяет осуществлять риск-ориентированное продвижение методов направленного воздействия на костную ткань на основе механистических данных in vivo.
- Способствует идентификации трансляционных биомаркеров, связанных с динамикой сигналинга остеоцитов.
- Связывает результаты этапа открытия с доклинической валидацией в интактных системах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод прижизненной визуализации объединяет этапы первичного поиска и доклинических исследований, позволяя напрямую проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути в живой костной ткани.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку механистических гипотез о реакциях остеоцитов на механические стимулы in vivo.
- Скрининг: Позволяет получать количественные и воспроизводимые измерения кальциевой сигнализации для подготовки анализа.
- Аналитика: Обеспечивает динамические флуоресцентные показатели для сравнения сигнализации при различных условиях нагрузки.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярные события сигнализации с функциональными результатами для всей кости в моделях соответствующих заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для исследований в области механобиологии в рамках программ по изучению костной ткани.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов в исследованиях механотрансдукции костной ткани.
- Практическая ценность: Стандартизирует рабочие процессы визуализации in vivo для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о целесообразности дальнейшей разработки и повышает эффективность использования капитала в НИОКР, направленных на воздействие на костную ткань.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию активов в области здоровья костей и скелетных заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области прижизненной визуализации и хирургических методик на мелких животных.
- Необходим доступ к двухфотонному микроскопу и оборудованию для обеспечения точного механического воздействия.
- Требуется межгрупповая стандартизация параметров визуализации и анализа данных.
- Адаптация метода для других участков кости или других моделей может потребовать оптимизации протокола.
- Согласно имеющимся данным, применение метода ограничено фундаментальными исследованиями на моделях мышей.
