Многопараметрический скрининг опухолевых органоидных препаратов с использованием широкоугольной визуализации живых клеток для объемного и одноорганоидного анализа

Этот протокол позволит исследователям не только оптимизировать свой аналитический конвейер, но также позволит им извлекать больше информации из своего органоидного потока, тем самым повышая трансляционную релевантность. Основным преимуществом этого протокола является то, что он сочетает в себе оптимизированный рабочий процесс с автоматизированным и клинически значимым конвейером анализа, что позволяет исследователям получать убедительный объем информации из одного органоидного экрана. Этот метод может быть использован для прогнозирования ответа на клиническую терапию для больных раком от этих скринингов органоидных препаратов ex vivo с очень многообещающими ранними результатами.

Цель состоит в том, чтобы сделать платформу программного решения независимой от платформы, чтобы исследователи могли использовать доступный им инструмент визуализации живых клеток. Начните с ферментативной диссоциации полученных пациентом опухолевых органоидов, или PDTO, во внеклеточном матриксе или ECM, куполах в шестилуночной микропластине. Для этого сначала аспирируйте среду, а затем промывайте купола ECM один раз PBS.

Затем добавьте два миллилитра фермента диссоциации в лунку. Пипетка содержимого вверх и вниз 10 раз с помощью одномилитровой пипетки для механической диссоциации органоидов в куполах перед инкубацией пластины в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия. После инкубации пипетка содержимого вверх и вниз и проверка правильной диссоциации органоидов к отдельным клеткам с помощью микроскопа.

Соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку и сделайте объем до 10 миллилитров, добавив адФ+Центрифугу в трубку при 450 г в течение пяти минут при комнатной температуре, и аспирируйте супернатант с помощью пипетки Пастера и всасывающего насоса. Повторно суспендировать гранулу в 100-200 микролитрах полной аденокарциномы протоков поджелудочной железы, или PDAC, органоидной культуральной среде в зависимости от размера гранулы перед подсчетом количества клеток с использованием метода выбора. Чтобы покрыть отдельные ячейки куполами ECM, разбавьте соответствующее количество клеточной суспензии, добавив необходимое количество размороженного ECM.

Затем пипетку до 10 20-микролитров капель на лунку в шестилуночной пластине предварительно нагревают до 37 градусов Цельсия. Переверните пластину и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Далее накладывают колодцы на полную среду, дополненную 10-микромоляром Y-27632, и инкубируют в течение двух-трех дней в инкубаторе.

Чтобы собрать двух-трехдневные органоиды, сначала аспирируйте среду и промывайте органоиды один раз PBS. Затем добавьте один-два миллилитра раствора для извлечения органоидов, предварительно охлажденного до четырех градусов Цельсия, в колодец шестилуночной пластины в зависимости от количества куполов ECM. Инкубировать пластину держат на льду, на встряхивающей платформе в течение 10 минут.

Теперь отделите купола ECM, пипетируя содержимое в скважинах вверх и вниз с помощью одномиллилитровой пипетки. Еще раз, инкубируйте органоиды в течение 10 минут на льду, прежде чем визуально подтвердить диссоциацию куполов ECM под микроскопом. Соберите органоиды в 15-миллилитровую трубку, предварительно покрытую 0,1% BSA в PBS, и доведите объем до 10 миллилитров, добавив ADF + Centrifuge в трубку по 200 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Затем аспирируют супернатант и повторно суспендируют гранулу в зависимости от ее размера в размере до одного миллилитра полной органоидной среды PDAC до желаемой конечной органоидной концентрации. Откройте приложение управления роботом-пипеткой, выберите «Протоколы» и нажмите «Импорт», прежде чем перетащить предоставленный дополнительный файл 6 в указанное поле. Выберите импортированный протокол.

И в соответствии с макетом, показанным в поле «Настройка колоды», поместите все лабораторное оборудование, включая охлаждающие элементы и пластиковую посуду, в палубы. Используйте левый слот для 25-миллилитрового резервуара и охлаждающего элемента. Затем нажмите «Запустить протокол» и перейдите к установке.

Откройте вкладку Labware Setup, нажмите «Выполнить проверку положения Labware» и следуйте инструкциям по калибровке робота-пипетки на новое оборудование. Заполните 25-миллилитровый резервуар, расположенный поверх охлаждающего элемента, охлажденным раствором для посева органоидов и нажмите кнопку «Начать запуск», чтобы привести в действие робота-пипетки. Далее центрифугируют микропластинку со скоростью 100 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.

Чтобы создать протокол дозирования лекарств с помощью программного обеспечения для управления цифровым диспенсером для лекарств, наведите курсор на пластину 1 над макетом пластины. Выберите «Редактировать атрибуты пластины» и заполните тип пластины как 384 well, дополнительный объем как 50 микролитров и предел DMSO как 1% Добавьте жидкости, нажав на кнопку добавления рядом с Fluids, и дважды щелкните на вновь созданной жидкости, чтобы назвать ее. Затем выберите класс на основе DMSO или водный плюс Tween 20 и введите концентрацию.

Чтобы создать макет пластины для титрования лекарств, выберите Уэллс и нажмите на Титрование. Для жидкости выберите интересующий препарат, наряду с желаемой самой высокой концентрацией и самой низкой концентрацией. Для реплик выберите не менее двух и выберите нужный шаблон титрования.

Чтобы создать макет пластины для положительного контроля, выберите три скважины, нажмите «Установить значение» и заполните двухмикролярный ставроспорин из 10-миллимолярного запаса в ДМСО, чтобы вызвать максимальную гибель клеток. Для Cytotox Green выберите все используемые скважины, нажмите «Установить значение» и введите значение 60 наномоляров на скважину. Для отрицательного контроля и нормализации DMSO выберите все скважины с дополнительными четырьмя скважинами для управления транспортным средством.

Теперь щелкните правой кнопкой мыши и выберите Нормализация, прежде чем назначать нормализованный класс жидкости на основе DMSO. Затем нормализуют до объема высшего класса, чтобы получить равную концентрацию ДМСО в каждой скважине. Затем нажмите на стрелку в разделе «Выполнить» в левом верхнем углу и выберите «Всегда имитировать», а затем нажмите «Имитировать», чтобы выявить любые ошибки и получить объемы каждого препарата, который необходимо подготовить.

Теперь снимите флажок «Всегда имитировать» под кнопкой «Выполнить», прежде чем нажать «Выполнить», чтобы запустить протокол дозирования лекарств, и следуйте инструкциям. Нанесите уплотнительную мембрану на микропластинку, чтобы предотвратить испарение. Откройте программное обеспечение управления образчиком live-cell и выберите Создать редактор методов перед переходом в файл, чтобы импортировать XML-файл примера метода.

Кроме того, следуйте инструкциям в рукописи, чтобы создать новый файл. Затем нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сканирование в T0.To объединить и сжать данные, создать новую родительскую папку для передачи всех отдельных папок эксперимента, созданных для каждого сканирования в каждый момент времени программным обеспечением управления образчиком живых клеток, и назвать соответствующие папки, следуя инструкциям, приведенным в рукописи. Подготовьте карту пластин XLSX в программном обеспечении для управления цифровым диспенсером для лекарств, щелкнув правой кнопкой мыши макет карты пластины из протокола дозирования лекарств и скопировав все колодцы, чтобы вставить данные в файл XLSX.

Удалите данные Cytotox Green и staurosporine, добавьте матрицу для клеточной линии и введите отрицательный контроль и положительный контроль. Откройте средство сжатия данных. Нажмите «Поиск», выберите родительскую папку и нажмите «Сжать», чтобы инициировать сжатие данных изображения.

Все файлы изображений TIFF сжимаются в один HDF5 для каждой скважины в новой папке наборов данных в родительской папке. Чтобы проанализировать изображения, перейдите на платформу веб-приложения для анализа изображений, войдите в систему и нажмите кнопку Добавить новый проект на вкладке Главная. Введите имя проекта, нажмите кнопку Продолжить и выберите Добавить новый эксперимент перед отправкой папки наборов данных, содержащей файлы HDF5.

После загрузки перейдите в папку проекта и эксперимента, чтобы нажать «Загрузить карту пластин» для получения дополнительных функций. Затем последовательно нажмите «Выполнить анализ», выберите «Анализ нескольких органоидов», «Параметры по умолчанию» и, наконец, «Анализ», чтобы начать анализ изображения. Нажмите «Загрузить результаты», чтобы загрузить таблицы необработанных данных, которые содержат измерения для каждой скважины и сегментированные изображения или видео, прежде чем подтвердить точность анализа для дальнейшей обработки данных.

Чтобы учесть различия в плотности и размере посева органоидов, были использованы метрики, основанные на скорости роста, для уменьшения вариаций между репликациями, о чем свидетельствуют уменьшенные полосы ошибок. Изображения для отрицательного контроля, положительного контроля и комбинированного ДПТО, получавшего гемцитабин и паклитаксел, показали, что терапия преимущественно индуцировала остановку роста с ограниченным количеством гибели клеток, соответствующим нормализованному лекарственному ответу, или NDR, значение чуть ниже нуля. При использовании двух дополнительных линий, PDAC_052 и PDAC_087, наблюдалась четкая разница в темпах роста между тремя линиями, что поддерживало использование показателей GR.

Кривые доза-реакция NDR привели к увеличению динамического диапазона и разделения между тремя различными пациентами по сравнению с кривыми GR. Определение NDR с течением времени показало, что PDAC_052 и PDAC_060 имели очень похожий цитостатический лекарственный ответ на низкую дозу гемцитабин-паклитаксела, в то время как для соответствующих средних и высоких доз можно было наблюдать четкий дифференциальный цитостатический и цитотоксический ответ. Эти лекарственные реакции соответствовали клиническим ответам, наблюдаемым у пациентов.

Клональная динамика показала, что у PDAC_087 были наиболее резистентные субклоны после лечения, что согласуется с агрессивным характером заболевания, наблюдаемым у пациента, который, что интересно, также был наименее чувствителен к положительному контролю ставроспорина. Наиболее важным аспектом протокола является охлаждение всех решений, содержащих ECM, во время посева, поскольку неправильное затвердевание ECM может помешать последующему анализу изображений. Автоматизация мокрой лабораторной работы, анализ изображений и последующая обработка данных могут быть полезны для ускорения исследований и более легкого выявления новых комбинированных методов лечения.