Оценка токсичности, ассоциированной с Т-клетками химерного антигенного рецептора, с использованием мышиной модели ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом

В этом протоколе используются человеческие CAR-T и опухолевые клетки, что позволяет точно продемонстрировать токсичность, связанную с введением CART19. Поэтому подытоживаем то, что наблюдалось в клинике. Основное преимущество использования этой платформы заключается в том, что она предоставляет переводимую и клинически значимую модель, в которой используются Т-клетки человека и опухолевые клетки.

Эта модель не только позволяет эффективно оценивать токсичность, ассоциированную с CART19, но и позволяет нам лучше понять, как мы можем преодолеть эту токсичность с помощью улучшенных стратегий лечения. Для начала наблюдайте за мышами, вводимыми CART19, два раза в день, чтобы оценить любые изменения в их самочувствии, такие как двигательная слабость, сгорбленная фигура и потеря массы тела. Как только у мышей разовьется двигательная слабость и снижение веса, соберите их периферическую кровь для анализа опухолевой нагрузки.

И провести выделение сыворотки крови на цитокины, как описано в рукописи. После выделения храните пробирки с сывороточными микроцентрифугами при температуре 80 градусов Цельсия и используйте cera для анализа хемокинов и цитокинов с помощью мультиплексного анализа. Для МРТ-визуализации смешайте 120 микролитров гадолиния с 880 микролитрами физиологического раствора и загрузите в инсулиновый шприц объемом один миллилитр.

Ввести по 100 микролитров приготовленного раствора внутрибрюшинно каждой мышке. Обезболивайте мышь и поместите ее на щуп подставки, совместимый с грызунами. Затем зацепите его зубчиками за прикусную планку.

Втяните головку мыши в катушку объемом 25 миллиметров и отрегулируйте носовой конус, привязанный к системе анестезии изофлураном. Затяните ручку прикусной планки, чтобы сохранить положение на протяжении всего сканирования. Для оценки дыхания приложите зонд устройства для мониторинга дыхания близко к диафрагме и закрепите его хирургической лентой.

Поддерживайте частоту дыхания от 20 до 60 вдохов в минуту, чтобы состояние мышей оставалось стабильным. Вставьте зонд животного в маленькое отверстие в системе МРТ для мелких животных с вертикальным отверстием и отрегулируйте голову животного в центре катушки. С помощью замка закрепите аппарат в вертикальном положении и подключите прибор к компьютеру.

Затем откройте программное обеспечение ParaVision, чтобы настроить позиции сканирования и типы сканирования. Определите оптимальные сагиттальные и осевые положения, сохраняя их одинаковыми для всех экспериментальных групп. Для сбора Т1-взвешенных данных МРТ используйте Т1-взвешенную многосрезовую последовательность с несколькими эхо-сигналами с временем повторения 300 миллисекунд, временем эхо-сигнала 9,5 миллисекунды, полем зрения 4,00 X 2,00 X 2,00 см и матрицей 192 X 96 X 96.

Для Т2-взвешенных МРТ-изображений используйте многосрезовую последовательность с несколькими эхо-сигналами с аналогичными параметрами. После завершения сканирования извлеките зонд из отверстия и осторожно извлеките мышь, удалив зубы с прикусной планки. После извлечения данных из программного обеспечения используйте аналитическое программное обеспечение для количественной оценки и объемной 3D-визуализации гиперинтенсивных областей CD19+ популяций опухолевых клеток между мышами, получавшими CART19, и мышами, не получавшими лечение с помощью проточной цитометрии.

Значительное снижение массы тела наблюдалось у мышей, получавших клетки CART19. Потеря веса рассматривается как симптом появления СВК, который связан с CART-клеточной токсичностью. Мультиплексный анализ выявил экспрессию цитокинов и хемокинов в сыворотке крови мышей NSG до и после введения CART19.

Т2-взвешенные изображения выявили признаки отека и возможного воспалительного инфильтрата во время нейровоспаления у мышей, получавших CART19. В то время как Т1-взвешенная МРТ показала контрастное усиление в паренхиме головного мозга, что указывает на увеличение проницаемости сосудов. Трехмерные реконструкции мозга грызунов были собраны на основе областей гиперинтенсивности Т1, соответствующих сосудистой проницаемости, которая визуализирует объем утечки гадолиния в мозге.

Важно помнить, что ежедневный физический мониторинг мышей после введения CART19, наряду с периферическим кровотечением, будет лучшим индикатором для проведения МРТ для полной оценки любых изменений в мозге, указывающих на CRS или нейротоксичность. Эта технология широко применима для дополнительной терапии CAR-T-клетками и позволит ученым эффективно тестировать потенциальную токсичность, возникающую от новых CAR-T-клеток. Эта предлагаемая модель является отправной точкой в понимании того, как токсичность, связанная с CAR-T-клетками, может контролироваться, лечиться и использоваться для валидации новых моделей CAR-T-клеток.