Прижизненная визуализация экспрессии флуоресцентных белков у мышей с закрытой черепно-мозговой травмой и краниальным окном с использованием двухфотонного микроскопа

Наш протокол позволяет визуализировать реакцию нейронов на механический стресс у живой мыши, что может предоставить прямое доказательство того, как черепно-мозговая травма влияет на мозг. Этот метод позволяет контролировать целевой белок в одном и том же месте мозга у одного и того же животного как в острой, так и в хронической фазе после черепно-мозговой травмы. Интересующий нас ген и промотор вируса могут быть изменены соответствующим образом для изучения других белков в конкретных типах клеток головного мозга.

Для начала нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши, находящейся под наркозом. Удалите волосы с макушки путем подравнивания обычными ножницами. После создания разреза по средней линии длиной от 12 до 15 миллиметров иссеките кожу над левым и правым полушариями черепа с помощью пружинных ножниц с изогнутым кончиком.

После того, как череп обнажен, удалите надкостницу, осторожно потерев ее стерильным аппликатором с ватным наконечником и промыв стерильным физиологическим раствором. После того, как область черепа высохнет, отметьте место черепно-мозговой травмы (ЧМТ) в координатах 2,5 миллиметра позади брегмы и на два миллиметра латеральнее сагиттального шва справа. Быстро извлеките мышь из стереотаксической рамки и поместите голову на буферную подушку под устройством ЧМТ.

Совместите наконечник ударника с отмеченным местом удара. Поднимите металлическую колонку, потянув за привязанную нейлоновую веревку на 15 сантиметров выше головы мыши, а затем отпустите ее, позволив весу свободно упасть на стержень датчика, который соприкасается с верхней частью черепа в месте ЧМТ. Поместите голову мыши, находящейся под наркозом, на стереотаксическую рамку, находящуюся под операционным микроскопом.

Осторожно и медленно просверлите поверхность черепа твердосплавным сверлом FG4 на низкой скорости вращения ротора, чтобы удалить оставшуюся надкостницу и создать шероховатую поверхность черепа, чтобы стоматологический цемент надежно сцепился с черепом. Используйте физиологический раствор, чтобы смыть и очистить поверхность черепа от костной пыли. Чтобы отделить боковые мышцы от черепа, примерно на пять миллиметров позади глаза, где расположен шов, соединяющий теменный и височный череп, осторожно введите тонкие закрытые кончики и осторожно сдвиньте закрытые кончики в заднем направлении до лямбдовидного шва.

Отделите боковые мышцы на той стороне, где будет происходить имплантация краниального окна. Смойте мусор с места операции с помощью физиологического раствора и высушите область марлей. Чтобы имплантировать штифт головы, отметьте центральную точку на расстоянии 2,5 миллиметра позади брегмы и на расстоянии 1,5 миллиметра от сагиттального шва на правом полушарии с помощью маркера и хирургического штангенциркуля.

Затем обведите окружность трепанации черепа на чистом и сухом черепе. Ослабьте амбушюру и поверните головку так, чтобы плоскость трепанации черепа была идеально горизонтальной, а затем снова затяните ушную планку. Используйте деревянную палочку аппликатора с хлопчатобумажным наконечником, чтобы добавить две небольшие капли суперклея на передний и задний края стойки для головы.

Расположите титановый головной штифт над центром трепанации черепа и быстро отрегулируйте его так, чтобы он находился в той же плоскости, где будет имплантировано краниальное окно. Слегка надавливайте до тех пор, пока суперклей не высохнет, что обычно занимает около 30 секунд. Приготовьте стоматологический цемент в предварительно охлажденной керамической посуде, тщательно смешав 300 миллиграммов цементного порошка, шесть капель жидкости QuickBase и одну каплю катализатора.

Быстро нанесите большое количество стоматологической цементной смеси на внешний периметр обведенной окружности и покройте любую открытую поверхность кости. Однако не закрывайте место трепанации черепа. Отпустите амбушюру и закрепите головной штырь на металлической раме, чтобы обеспечить устойчивость головки для точного сверления по отмеченной окружности краниотомии.

Чтобы выполнить трепанацию черепа, используйте хирургический штангенциркуль, чтобы проверить диаметр отмеченного круга, как показано выше, и при необходимости отрегулируйте его так, чтобы краниальное окно плотно прилегало к краниотомии. С помощью электрической бормашины вытравите и утончите череп вдоль внешней стороны отмеченного круга с помощью твердосплавной коронки FG4, которая создает дорожку, в пределах которой следует проредить череп. Орошайте участок физиологическим раствором, чтобы смыть костную пыль.

Продолжайте прореживать череп твердосплавным сверлом FG 1/4 до тех пор, пока череп не станет тонким и прозрачным. Периодически прекращайте сверление и снова орошайте всю область стерильным физиологическим раствором, чтобы уменьшить нагрев от дрели и смыть костную пыль. Завершите истончение черепа с помощью твердосплавной коронки EF4 и продолжайте утончение и сверление остальной части черепа вдоль дорожки.

Введите 0,5-миллиметровые щипцы с тонким наконечником через трещину и осторожно приподнимите костный лоскут вверх, не вдавливая в нижележащий мозг. После удаления костного лоскута орошите область краниотомии физиологическим раствором. С помощью хирургических щипцов с изогнутым наконечником аккуратно удалите видимое паутинное вещество.

Используйте хирургические щипцы с прямым наконечником, чтобы взять стерильное стеклянное окно с трехмиллиметровой стеклянной крышкой вниз. Разместите и отрегулируйте стеклянное окно над местом трепанации черепа, чтобы убедиться, что окно плотно прилегает к краю краниотомии. Пятимиллиметровая стеклянная крышка находится сверху.

Приготовьте стоматологический цемент, как показано ранее, и подождите примерно шесть минут, пока цемент не станет пастообразным и густым. Ожидая, пока цемент станет пастообразным и густым, приложите достаточное давление к окну через стереотаксический манипулятор, чтобы убедиться, что череп может надежно и плотно соприкасаться со стеклянным окном. Используйте регулируемую точную кисть-аппликатор, чтобы добавить небольшое количество цемента вдоль края окна, чтобы закрыть стеклянное окно с черепом.

Подождите примерно 10 минут, чтобы цемент полностью высох, затем осторожно отпустите и снимите манипулятор над окном. Завершите обрезкой стоматологического цемента с помощью стоматологической бормашины с твердосплавным сверлом FG4, если излишки цемента покрывают окно. Примерно через четыре часа после операции была проведена двухфотонная визуализация, где на поверхностном уровне сосудистая сеть казалась черной, а на глубоком уровне примерно 400 микрометров экспрессия белка EGFP была диффузно распределена по всему телу клетки.

Через одну неделю и четыре месяца после ЧМТ в качестве эталона для определения местоположения той же области визуализации использовался паттерн сосудистой сети, наблюдаемый в нулевой момент времени. Сосудистая сеть аналогична той, что была на нулевой день. Аналогичным образом, экспрессия EGFP была обнаружена по всему телу клетки.

Интенсивность флуоресценции на нулевой день и через четыре месяца была одинаковой как на поверхностном, так и на более глубоком уровнях. Тем не менее, интенсивность флуоресценции через одну неделю была ниже, чем на нулевой день и четыре месяца, возможно, из-за трансляционной репрессии, о которой сообщалось для других моделей ЧМТ. Очень важно соблюдать максимальную осторожность при проведении этапа трепанации черепа, чтобы не повредить ткани головного мозга.

Не вставляйте наконечник сверла в мозг. Используя этот метод, исследователи могут визуализировать различные интересующие белки в одной и той же клетке в продольном направлении через разные фазы после ЧМТ, предоставляя информацию о локализации, экспрессии и растворимости этого белка в мозге млекопитающих после травмы.