Оценка целостности кишечного барьера у мышей с использованием меченного флуоресцеин-изотиоцианатом декстрана
18 ноября 2022 г.
В настоящем исследовании меченый флуоресцеин-изотиоцианатом декстран вводят мышам через ротовой зонд для оценки проницаемости кишечника как in vivo, так и в образцах плазмы и фекалий. Поскольку барьерная функция кишечника затрагивается во многих болезненных процессах, этот прямой и количественный анализ может быть использован в различных областях исследований.
Этот метод помогает ответить на вопросы о том, изменяет ли состояние целостность кишечного барьера, или на вопросы о том, может ли потенциальное лечение поддерживать целостность кишечного барьера. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предлагает неинвазивный метод с низкой нагрузкой для оценки и количественной оценки проницаемости кишечника in vivo. Для начала постите мышей в течение четырех часов, затем введите 200 микролитров суспензии FITC-декстрана через ротовой зонд каждой мыши, используя 38-миллиметровую стерилизованную иглу изогнутого зонда 22-го калибра.
Запустите таймер после первого зонда и подождите от пяти до 10 минут между каждым зондом, чтобы обеспечить измерения in vivo, сохраняя один час после зонда. Оставьте оставшуюся подвеску FITC-декстрана для стандартной кривой. Запустите машину и программное обеспечение, нажав и удерживая кнопку запуска, и дайте системе прогреться.
Нажмите «Состояние устройства» и убедитесь, что все настроенные устройства показывают «ОК», прежде чем продолжить. Затем нажмите «Новое исследование» и сохраните файл с нужным именем. Затем нажмите «Параметры обучения».
Введите идентификатор образца, выберите правильный лазер и поэкспериментируйте. Затем удалите мех с области живота с помощью электробритвы и щедро нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Откройте камеру визуализации и поместите животное дорсально на сканирующую пластину.
Затем закрепите конечности и хвост скотчем. Затем выберите область для сканирования с помощью инструмента «Рисование». Убедитесь, что вы включили всю ширину живота от чуть выше печени до прямой кишки.
Затем нажмите на инструмент «Изменить», чтобы настроить область после рисования. Установите разрешение сканирования на 2.0 миллиметра и нажмите «Пуск», чтобы начать сканирование. Затем откройте файлы изображений, найдя их под выбранным именем файла, и одновременно откройте все файлы с синхронизированными настройками.
Используя панель инструментов параметров изображения, используйте кнопки «Синхронизировать изображение» и «Синхронизировать масштаб», чтобы синхронизировать настройки изображения для точного сравнения. Затем сохраните изображения с отрегулированными масштабами. Сравните брюшную флуоресценцию каждого животного и контрольной мыши на равномерно масштабированных изображениях с помощью программного обеспечения, связанного с системой визуализации.
Соберите гранулы фекалий от каждой мыши в стерильную пробирку через четыре часа после зонда. Затем держите трубки на льду и поместите их в темноту. Затем центрифугируют образцы крови при 9 390 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем переложите плазму в новую стерильную пробирку и держите ее на льду в темноте. Разведите 50 миллиграммов образцов фекалий в 200 микролитрах PBS и разбавьте плазму PBS в соотношении один к двум. Пластина 100 микролитровых образцов и стандартов в непрозрачной черной 96-луночной пластине.
Считывание флуоресценции на считывателе флуоресцентных пластин с возбуждением при 485 нанометрах и поглощением при 530 нанометрах. Наконец, определите концентрацию FITC-декстрана на образец, сравнив флуоресценцию с известными концентрациями стандартной кривой. Анализ флуоресценции in vivo показал, что мыши, получавшие только контрольную диету, имели более высокое потребление FITC-декстрана в печени и более высокие уровни остаточной флуоресценции в брюшной полости по сравнению с мышами, получавшими диету с добавлением инулина.
Мыши, получавшие диету с добавлением инулина, имели значительно более низкие уровни FITC-декстрана в плазме по сравнению с мышами, получавшими только контрольную диету. Соответственно, мыши, получавшие инулиновую диету, имели значительно более высокие уровни FITC-декстрана в фекалиях, чем мыши, получавшие только контрольную диету. Более низкие уровни FITC-декстрана в фекалиях контролируемых мышей указывают на то, что он проникал через кишечный барьер в кровоток, а не выводился надлежащим образом.
Высокие уровни FITC-декстрана в плазме подтвердили это открытие. Время имеет важное значение при попытке этой процедуры. Флуоресцентное считывание и сбор образцов должны происходить как можно ближе к одному часу и четырем часам после зонда для каждой отдельной мыши.
Обзор
В данном исследовании оценивается кишечная проницаемость у мышей с использованием декстрана, меченного флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), который вводится путем перорального зондирования. Этот метод позволяет оценить функцию кишечного барьера in vivo, что имеет решающее значение для понимания различных патологических процессов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Целостность кишечного барьера
- Исследования на животных моделях
- Методы неинвазивной оценки
Теоретические основы
- При патологических состояниях часто изменяется проницаемость кишечника.
- Поддержание целостности кишечного барьера имеет решающее значение для здоровья.
- Для исследований на животных предпочтительны неинвазивные методы.
Используемые методы
- Введение FITC-декстрана с помощью перорального зондирования
- Мыши в качестве экспериментальной биологической системы
- Флуоресцентный планшетный ридер для количественного анализа
Основные результаты
- У мышей на контрольной диете наблюдались более высокие уровни флуоресценции печени по сравнению с мышами на диете с добавлением инулина.
- У мышей, получавших диету с инулином, наблюдались более низкие уровни FITC-декстрана в плазме.
- У мышей с добавлением инулина в рацион наблюдались более высокие уровни FITC-декстрана в фекалиях, что указывает на эффективное поддержание кишечного барьера.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует надежный метод оценки функции кишечного барьера.
- Результаты подчеркивают важность диетических вмешательств для поддержания целостности кишечника.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка целостности кишечного барьера имеет решающее значение для снижения рисков на ранних стадиях программ, направленных на улучшение здоровья кишечника и борьбу с системным воспалением. Анализ с использованием FITC-декстрана обеспечивает прямой считываемый в реальном времени показатель кишечной проницаемости, что позволяет уверенно оценивать терапевтические вмешательства и модификации диеты в доклинических моделях. Эта возможность способствует принятию прогностических решений на стыке фундаментальной биологии и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую оценивать функцию кишечного барьера в качестве механистической конечной точки.
- Обеспечивает биологическое снижение рисков для мишеней, модулирующих целостность слизистой оболочки.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе кандидатов для терапии заболеваний кишечника.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную количественную систему для измерения кишечной проницаемости in vivo.
- Стандартизирует результаты анализа для обеспечения воспроизводимости при скрининге различных соединений и диетических вмешательств.
- Обеспечивает масштабируемую неинвазивную оценку модуляторов кишечного барьера на моделях животных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет доклинические показатели с соответствующими заболеванию биомаркерами здоровья кишечника.
- Обеспечивает преемственность этапов от открытия до доклинической валидации методов терапии, направленных на кишечный барьер.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе функциональных результатов состояния кишечного барьера.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный анализ с использованием FITC-декстрана интегрирован в цикл от фундаментальных исследований до доклинических испытаний, связывая изучение механизмов и трансляционную валидацию биомаркеров функции кишечного барьера.
- Открывающая биология: Количественно оценивает влияние генетических, диетических или фармакологических вмешательств на проницаемость слизистой оболочки.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для сравнительного анализа потенциальных методов вмешательства.
- Аналитика: Предоставляет измерения на основе флуоресценции, позволяющие проводить статистическое сравнение целостности кишечного барьера между группами.
- Трансляционные исследования: Соответствует стратегиям использования клинических биомаркеров проницаемости кишечника при продвижении кандидатов.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает стандартизированную, многократно используемую платформу для оценки кишечного барьера в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов при модуляции кишечного барьера и валидации мишеней.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и пропускную способность анализа в рамках доклинических исследований.
- Стратегическая ценность: Облегчает принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), обеспечивая прямое функциональное считывание целостности барьера.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию активов с учетом рисков при воздействии на здоровье кишечника или системное воспаление.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с животными, проведения перорального зондирования и флуоресцентной визуализации.
- Необходим доступ к системам визуализации in vivo и флуоресцентным планшетным ридерам.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межкомандная стандартизация времени проведения процедур и обработки образцов.
- Метод может быть адаптирован для различных моделей диетических, генетических или фармакологических вмешательств у мышей.
- Своевременный сбор образцов имеет решающее значение для точной оценки проницаемости.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Administration of FITC-Dextran
1:09
In Vivo Fluorescence Measurement
2:44
Fluorescence Measurement in Fecal Samples and Plasma
3:50
Results: Dietary Supplementation with Inulin and the Translocation of FITC-Dextran
4:45
Conclusion
